Techniques

[Sulnac]

Bonjour, j'ai plusieurs questions à propos des expériences de Western Blot et Dot Blot en conditions réductrices ou non.

- Le SDS-PAGE dénature les sous-unités des protéines donc est-ce qu'un Western Blot en conditions non dénaturantes révèle les épitopes séquentiels ?

- Les réducteurs coupe les ponts S-S donc est-ce que le Dot Blot en conditions réductrices révèle les épitopes séquentiels et le Dot Blot en conditions non dénaturantes révèle les épitopes non conformationnels ?

- Est ce que les SDS-PAGE en conditions dénaturantes ou non changent quelque chose ?

Merci!

[Moustache]

Coucou @Sulnac je ne sais pas si ça répond à tes questions mais j'ai écris que quand c'est dénaturant on ne va avoir que des épitopes séquentiels donc pas possible d'avoir les conformationnels 

Si je dis pas de bêtise SDS c'est toujours dénaturant donc on aura que des épitopes séquentiels 

Voilà si ça peut t'aider 

Ah oui aussi (je l'ai appris pendant la formation pharma) dénaturé= purifié donc si dans un enoncé on parle de truc purifié c'est dénaturant donc épitopes  séquentiels 

[lizou]

Hello @Sulnac !

 

Il y a 13 heures, Sulnac a dit :

Le SDS-PAGE dénature les sous-unités des protéines donc est-ce qu'un Western Blot en conditions non dénaturantes révèle les épitopes séquentiels ?

Comme l'a dit @Moustache, en théorie dans un Western Blot on met forcément du SDS, dans ce cas, la protéine va perdre sa conformation, donc tu perds les épitopes conformationnels et tu révèles les épitopes séquentiels (si tu as l'anticorps correspondant dans ton Western Blot biensûr) puisque la protéine sera dénaturée, et tu mets en plus le beta-mercaptoéthanol pour casser les pont SS, pour avoir vraiment la protéine 100% dénaturée et avoir "accès" à toute sa séquence d'AA. 

Maintenant si tu fais un western blot en conditions non dénaturantes donc sans SDS (je sais pas si ça existe mais on sait jamais), la protéine va rester dans sa conformation donc repliée etc, donc tu n'auras pas accès à tous les épitopes séquentiels, mais tu auras les conformationnels. 

 

Il y a 13 heures, Sulnac a dit :

Les réducteurs coupe les ponts S-S donc est-ce que le Dot Blot en conditions réductrices révèle les épitopes séquentiels et le Dot Blot en conditions non dénaturantes révèle les épitopes non conformationnels ?

Les réducteurs vont juste casser les ponts mais la protéine va garder plus ou moins la même forme, la même conformation, elle va pas être dénaturée comme avec le SDS qui va "linéariser" (on va dire ça) la protéine en une chaine, une séquence d'AA toute simple pour dévoiler les épitopes séquentiels (d'où le nom). 

Si le dot blot est non dénaturant, donc sans SDS (encore une fois je sais pas si ca existe en pratique un dot blot sans sds), la protéine va garder sa forme, sa conformation qu'elle a acquéri par les liaisons H, ioniques etc. Donc tu ne vas pas avoir les épitopes "non conformationnels" puisque la protéine est "conformationnelle" sans le SDS (tu as utilisé ce terme de "épitopes non conformationnels", je suppose que tu as voulu parler des épitopes séquentiels du coup?). Ces épitopes conformationnels ne sont repérables que quand la protéine est dans sa conformation native (c'est le terme pour dire non dénaturée, dans sa conformation où elle est fonctionnelle).

 

Il y a 14 heures, Sulnac a dit :

Est ce que les SDS-PAGE en conditions dénaturantes ou non changent quelque chose ?

Le SDS par définition est dénaturant, c'est dans la nature de sa molécule de dénaturer (il va entourer les AA de la protéine de charges négatives qui vont donc toutes se repousser et "linéariser" la protéine qui perd donc sa conformation) , il est toujours dénaturant. 

 

Voilà, je suis pas sûre d'avoir été très clair j'espère que j'ai pu t'aider! 

Bon courage !  

[Sulnac]

Salut @lizou, merci pour l'explication, il y a juste qqchose que je ne suit pas d'avoir saisit

En fait dans le nom SDS-PAGE :

- SDS = dénaturant

- PAGE = migration

mais pour le dot blot il n'y a que le SDS donc révélation des épitopes conformationnels ?

 

[lizou]

Mmh je pense que t'embrouilles ahah @Sulnac ! 

En gros, le SDS est une molécule qui va casser les liaisons non covalentes dans une solution avec des protéines.

Le SDS page est une technique qui permet de mesurer le poids des protéines (de leurs sous-unités car elles sont donc dénaturées par le SDS). C'est le fait de mettre cette solution protéines+SDS sur une plaque polarisée par une électrode. Tu déposes ton mélange sur le coté chargé - de la plaque, et comme toutes tes protéines seront chargées - puisqu'entourées de SDS (qui est une molécule chargée -) , elles vont migrées vers l'electrode + ( car le négatif et le positif s'attirent), et plus la protéine est grosse, moins elle va loin = le SDS page est une technique qui permet de séparer les protéines/les sous unités de protéines  (car dénaturées par le SDS) en fonction de leur poids. Ce n'est pas à chaque mot sa définition comme tu le dis  

 

Le SDS dénature les protéines, qui perdent alors leur conformation. Donc si tu rajoutes du SDS dans tes protéines, peu importe quelle technique tu utilises  (dot blot, SDS page, Western Blot...) elles seront dénaturées et tu perdras les épitopes conformationnels car elles n'auront plus leur conformation. 

 

[Sulnac]

Merci, je voulais dire séquentiel plutot