Ilyatrogène Posted March 21, 2021 Posted March 21, 2021 Salut, j'ai l'impression que des fois c'est un peu du hasard le fait d'affirmer ou pas si deux Ac reconnaissent le même épitope, si c'est phosphoré, si c'est une réaction croisée etc.. Dans ce QCM par exemple je comprends pas comment on peut affirmer que la C est vrai, ça aurait pu être des cellules différentes mais présentant les mêmes épitoges donc reconnues par le même marquage ? énoncé : https://goopics.net/i/10rrK correction : https://goopics.net/i/QZpp3 Merci d'avance ** pour l'item D de ce même qcm je l'ai compté faux mais je ne comprends pas la correction car je croyais qu'ELISpot pouvait aussi identifier les cellules sécrétrices d'Ag en plus des plasmocytes/hybridomes sécréteurs d'Ac ? Quote
Ancien Responsable Matière Sarhabdomyocyte Posted March 22, 2021 Ancien Responsable Matière Posted March 22, 2021 Coucou!!! Le 21/03/2021 à 09:49, ilyanapafini a dit : Dans ce QCM par exemple je comprends pas comment on peut affirmer que la C est vrai, ça aurait pu être des cellules différentes mais présentant les mêmes épitoges donc reconnues par le même marquage ? justement l'objectif est de regarder si les anticorps reconnaissent les mêmes cellules... Par exemple dans la coupe tu marques les anticorps du LCR en rouge et les Acm en vert : tu observes la coupe, et si tu vois un signal jaune sur des cellules ça veut dire que les deux anticorps co-localisent à ce niveau (rouge + vert = jaune) Le 21/03/2021 à 09:49, ilyanapafini a dit : pour l'item D de ce même qcm je l'ai compté faux mais je ne comprends pas la correction car je croyais qu'ELISpot pouvait aussi identifier les cellules sécrétrices d'Ag en plus des plasmocytes/hybridomes sécréteurs d'Ac ? oui oui, mais ici les cellules ne sécrètent pas AK5, l'énoncé te dit que c'est une molécule cytosolique, donc ce n'est pas identifiable en ELISpot Bon courage Ilyatrogène 1 Quote
Ilyatrogène Posted March 22, 2021 Author Posted March 22, 2021 Merci pour ta réponse @TutoSarhabdomyocyte ! il y a une heure, TutoSarhabdomyocyte a dit : l'énoncé te dit que c'est une molécule cytosolique, donc ce n'est pas identifiable en ELISpot je ne comprends pas pourquoi... une molécule cytologique est une molécule contenue dans le cytoplasme d'une cellule du coup je ne vois pas trop ce que ça explique ... il y a une heure, TutoSarhabdomyocyte a dit : justement l'objectif est de regarder si les anticorps reconnaissent les mêmes cellules... Par exemple dans la coupe tu marques les anticorps du LCR en rouge et les Acm en vert : tu observes la coupe, et si tu vois un signal jaune sur des cellules ça veut dire que les deux anticorps co-localisent à ce niveau (rouge + vert = jaune) En fait le problème que j'ai c'est que des fois c'est justement le but que la réaction marche mais on ne peut pas l'affirmer comme ici par exemple ça aurait pu être des Acm qui reconnaissent qqchose qui est localisé au même endroit que ce qui est identifié par l'Ac mais pas la même chose ... Quote
Ancien Responsable Matière Solution Sarhabdomyocyte Posted March 22, 2021 Ancien Responsable Matière Solution Posted March 22, 2021 il y a 11 minutes, ilyanapafini a dit : je ne comprends pas pourquoi... une molécule cytologique est une molécule contenue dans le cytoplasme d'une cellule du coup je ne vois pas trop ce que ça explique ... Une molécule cytosolique réside dans le cytosol, alors qu'une molécule sécrétée sort de la cellule. Le principe d'ELISpot, c'est de placer des anticorps spécifiques de l'antigène sécrété par ta cellule d'intérêt au fond d'un milieu du culture, puis d'y placer des cellules et de les cultiver. Les cellules sécrétrices d'intérêt, s'il y en a, sécrèteront l'Ag qui se fixera aux Ac spécifiques fixés au fond. Ensuite, on enlève les cellules puis on place dessus d'autres anticorps aussi spécifiques de l'Ag mais pas du même épitope que les anticorps fixés au fond du puits ; les anticorps ajoutés sont marqués (un peu à la manière d'ELISA sandwich) et ce marquage révèle des tâches ("spot") dans le milieu de culture qui révèlent donc la présence initiale d'une cellule sécrétrice de l'Ag. Je te conseille d'aller voir la diapo de la formation immunologie de pharma du TAT, qui est très claire je trouve sur le protocole ELISpot. Tu ne peux donc pas repérer une molécule cytosolique, puisqu'elle ne sort pas de la cellule, elle ne peut pas se lier aux anticorps fixés au fond du milieu de culture ! A retenir juste absolument : ELISpot = numération de cellules sécrétrices il y a 17 minutes, ilyanapafini a dit : En fait le problème que j'ai c'est que des fois c'est justement le but que la réaction marche mais on ne peut pas l'affirmer comme ici par exemple ça aurait pu être des Acm qui reconnaissent qqchose qui est localisé au même endroit que ce qui est identifié par l'Ac mais pas la même chose ... Ici dans l'expérience, l'anticorps monoclonal est parfaitement caractérisé comme dit dans l'énoncé, il ne peut reconnaître que AK5. Pour les anticorps présents dans le LCR c'est pareil, tu les as parfaitement caractérisé grâce aux Western Blot, puisque pour les 2 LCR il y a du signal pour des cellules AK5+ et pas pour AK5- (alors que du coup la seule chose qui change entre les deux extraits cellulaires c'est la présence d'AK5 donc c'est nécessairement ça la source du signal), et en plus avant d'être utilisés en immunotransfert ces anticorps ont eux-mêmes été purifiés à partir d'une AK5 recombinante donc ils reconnaissent cette protéine. Preuve ultime : l'usage du LCR A déplété qui montre qu'aucun anticorps autre que celui isolé par purification avec AK5 recombinante ne reconnaît AK5 en immunotransfert (pas de signal), donc le signal obtenu pour les anticorps purifiés du LCR A est bien dû uniquement à ces anticorps là parfaitement purifiés. En fait, quand on veut faire cette expérience d'immunofluorescence, on a déjà parfaitement caractérisé les anticorps !! On sait déjà qu'ils sont spécifiques d'AK5. On veut juste savoir si ils reconnaissent les mêmes cellules, pas les mêmes antigènes. C'est plus clair ? Ilyatrogène 1 Quote
Ilyatrogène Posted March 22, 2021 Author Posted March 22, 2021 il y a 17 minutes, TutoSarhabdomyocyte a dit : Une molécule cytosolique réside dans le cytosol, alors qu'une molécule sécrétée sort de la cellule. Le principe d'ELISpot, c'est de placer des anticorps spécifiques de l'antigène sécrété par ta cellule d'intérêt au fond d'un milieu du culture, puis d'y placer des cellules et de les cultiver. Les cellules sécrétrices d'intérêt, s'il y en a, sécrèteront l'Ag qui se fixera aux Ac spécifiques fixés au fond. Ensuite, on enlève les cellules puis on place dessus d'autres anticorps aussi spécifiques de l'Ag mais pas du même épitope que les anticorps fixés au fond du puits ; les anticorps ajoutés sont marqués (un peu à la manière d'ELISA sandwich) et ce marquage révèle des tâches ("spot") dans le milieu de culture qui révèlent donc la présence initiale d'une cellule sécrétrice de l'Ag. Je te conseille d'aller voir la diapo de la formation immunologie de pharma du TAT, qui est très claire je trouve sur le protocole ELISpot. Tu ne peux donc pas repérer une molécule cytosolique, puisqu'elle ne sort pas de la cellule, elle ne peut pas se lier aux anticorps fixés au fond du milieu de culture ! A retenir juste absolument : ELISpot = numération de cellules sécrétrices Ici dans l'expérience, l'anticorps monoclonal est parfaitement caractérisé comme dit dans l'énoncé, il ne peut reconnaître que AK5. Pour les anticorps présents dans le LCR c'est pareil, tu les as parfaitement caractérisé grâce aux Western Blot, puisque pour les 2 LCR il y a du signal pour des cellules AK5+ et pas pour AK5- (alors que du coup la seule chose qui change entre les deux extraits cellulaires c'est la présence d'AK5 donc c'est nécessairement ça la source du signal), et en plus avant d'être utilisés en immunotransfert ces anticorps ont eux-mêmes été purifiés à partir d'une AK5 recombinante donc ils reconnaissent cette protéine. Preuve ultime : l'usage du LCR A déplété qui montre qu'aucun anticorps autre que celui isolé par purification avec AK5 recombinante ne reconnaît AK5 en immunotransfert (pas de signal), donc le signal obtenu pour les anticorps purifiés du LCR A est bien dû uniquement à ces anticorps là parfaitement purifiés. En fait, quand on veut faire cette expérience d'immunofluorescence, on a déjà parfaitement caractérisé les anticorps !! On sait déjà qu'ils sont spécifiques d'AK5. On veut juste savoir si ils reconnaissent les mêmes cellules, pas les mêmes antigènes. C'est plus clair ? Merciiiiii beaucoup d'avoir pris le temps de m'expliquer tout ça je comprends beaucoup mieux !! Sarhabdomyocyte 1 Quote
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