recherche plasmide

[mls]

salut  
je ne comprends pas bien dans ce qcm : l'item C, lors de l'insertion, on ne doit pas nécessairement coupé par la meme enzyme qui a digéré le plasmide précédent ? j'avais compris que les enzymes devaient êtres similaires pour pouvoir l'insertion. si qqn peut du coup m'expliquer, merciii d'avance 

[OxyGenS]

Salut @mls,

 

Dans l'item C on te demande si en coupant le vecteur recombinant par l'enzyme de restriction Pte1 on pourra déterminer le sens d'insertion du cDNA codant pour CXCL1.

La réponse est oui !

 

Il ne faut pas confondre cette étape avec l'étape de construction du vecteur recombinant.

Tu vas bien construire ton vecteur recombinant en digérant les 2 plasmides par BamH1 --> tu récupères le cDNA du vecteur pCK-CXCL1 et grâce à la ligase tu l'insères au niv du site de restriction BamH1 dans le vecteur pPACES.

Puisque tu fais toutes ces étapes avec la même enzyme c'est un clonage non orienté : on ne maîtrise pas le sens d'insertion du cDNA.

 

Pour savoir dans quel sens il s'est inséré tu prends une autre enzyme de restriction que tu fais agir sur le plasmide recombinant : en fct de la taille des fragments obtenus tu pourras dire s'il est dans le bon sens pour être transcrit + traduit ou bien s'il est dans le mauvais sens (et dans ce cas il ne pourra qu'être transcrit mais pas traduit).

Dans ton QCM, Pte1 va couper le plasmide recombinant à 2 endroits : sur le site de clivage initialement présent sur le plasmide pPACES et sur le site de clivage présent sur le cDNA.

Précision : il faut que l'enzyme ait au moins 2 sites de clivage sur le vecteur recombinant. En effet s'il n'y en a qu'un tu vas simplement linéariser le vecteur donc tu auras une bande faisant la taille du vecteur recombinant mais aucune info sur le sens d'insertion : qu'il soit dans le bon ou le mauvais sens la taille de la bande sera la même.

 

C'est plus clair ?

Edited March 10, 2021 by OxyGenS

[vb27]

^{Salut, l'item ne te parle pas des enzymes qui ont servi à faire l'insertion mais de comment savoir si ton vecteur a intégré ton ADNc dans le bon sens ou pas c'est à dire savoir si le 5' est bien en 5' du plasmide et que donc la transcription sera possible. Ici, on peut voir dans l'ADNc qu'il y a un site pour l'enzyme de restriction Pte1 en début, vers le 5'. Donc par traitement par cette enzyme, en fonction de la taille des fragments que tu vas obtenir tu saura si ton ADNc est inséré dans le bon sens ou pas !}

^{Tu peux regarder l'item C de ce post!}

 

 

 

[mls]

il y a 29 minutes, OxyGenS a dit :

Salut @mls,

 

Dans l'item C on te demande si en coupant le vecteur recombinant par l'enzyme de restriction Pte1 on pourra déterminer le sens d'insertion du cDNA codant pour CXCL1.

La réponse est oui !

 

Il ne faut pas confondre cette étape avec l'étape de construction du vecteur recombinant.

Tu vas bien construire ton vecteur recombinant en digérant les 2 plasmides par BamH1 --> tu récupères le cDNA du vecteur pCK-CXCL1 et grâce à la ligase tu l'insères au niv du site de restriction BamH1 dans le vecteur pPACES.

Puisque tu fais toutes ces étapes avec la même enzyme c'est un clonage non orienté : on ne maîtrise pas le sens d'insertion du cDNA.

 

Pour savoir dans quel sens il s'est inséré tu prends une autre enzyme de restriction que tu fais agir sur le plasmide recombinant : en fct de la taille des fragments obtenus tu pourras dire s'il est dans le bon sens pour être transcrit + traduit ou bien s'il est dans le mauvais sens (et dans ce cas il ne pourra qu'être transcrit mais pas traduit).

Dans ton QCM, Pte1 va couper le plasmide recombinant à 2 endroits : sur le site de clivage initialement présent sur le plasmide pPACES et sur le site de clivage présent sur le cDNA.

Précision : il faut que l'enzyme ait au moins 2 sites de clivage sur le vecteur recombinant. En effet s'il n'y en a qu'un tu vas simplement linéariser le vecteur donc tu auras une bande faisant la taille du vecteur recombinant mais aucune info sur le sens d'insertion : qu'il soit dans le bon ou le mauvais sens la taille de la bande sera la même.

 

C'est plus clair ?

oui parfait merci bcp!