lorinne Posted March 3, 2021 Posted March 3, 2021 hey *quand on nous demande si un premier ADN coupé par une enzyme n°1 pourra être ligatué par une ligase à un second ADN coupé par une enzyme n°2 est-ce que ça marche obligatoirement si les 2 génèrent des bouts francs ? ça ne marche pas si une génère des bouts collants et l'autre des bouts francs, c'est ça ? et si elles génèrent toutes 2 des bouts collants comment on sait si ça marche ex : bam1 : 5'GAGCT/C 3' alu1 : 5' GAGCT/C 3' *qu'est-ce qu'un promoteur constitutif de gène domestique ? *je comprends pas pourquoi cette phrase est fausse : un ADNc correspond à la séquence entre le codon d'initiation de la traduction et le codon stop? *pourquoi dans cette situation : https://ibb.co/mvkgdsb pourquoi le plasmide recombinant ne peut pas être construit en digérant le plasmide et l'ADNc par ECOR1 et NCO1? *pourquoi le séquençage de nouvelle génération (automatique) ne nécessite plus de radioactivité sur l'amorce ? *quand on nous donne une situation comme celle-là : https://ibb.co/PY66N8t comment sait-on que B est la matrice et A la réplication ? *par rapport à la méthode de séquençage selon sanger, pourquoi elle nécessite l'hybridation d'une amorce ADN en 3' du brin matrice et pas 5'? *est-ce que la seule différence qu'il y a entre un séquençage automatique et un séquençage classique c'est que dans le séquençage automatique on met les 4 ddNTP dans le même tube réactionnel ? *pourquoi la transgenese additive n'implique pas l'insertion d'une construction génique par recombinaison homologue ? *pourquoi la trangenese additive et la transgenese par recombinaison nécessite toutes 2 le transvfert des constructions géniques sous forme linéaire ? *pourquoi le système crispr/cas 9 n'est pas utilisé dans la transgénèse additive ? *est-ce que qqn peut me donner les différences fondamentales entre transgenese additive et transgenese par recombinaison ? *par rapport à l'obtention des souris tansgéniques par recombinaison homologue pourquoi dans cette technique on peut utiliser crispr/cas9 en présence d'un ADN de séquence homologue à la séquence cible ? *pourquoi la RTPCR ne permet pas de sélectionner les animaux transgénique ? merci Quote
Solution Marin Posted March 3, 2021 Solution Posted March 3, 2021 (edited) Coucou @lorinne ! Question 1 : Oui, si c'est des bouts collant ça marchera forcément. Un bout franc et un bout collant ça ne marche pas, il te faut te le représenter dans la tête. Tu as un bout franc (deux brins au même niveau) et un autre bout où un morceau d'adn 'dépasse' un peu, ça va être difficile de coller les deux sans tordre un brin ou faire un trou quelque part tu vois ? Pour savoir si les deux extrémités collantes étaient compatibles ce que je faisais perso c'est que j'écrivais les séquences de l'exo au brouillon et j'écrivais les complémentaires (en inversant bien 5' et 3'). Une fois que c'était fait je dessinait une ligne qui représentait la coupure sur les deux brins. Une fois que c'était fait je regardais mes deux séquences. Est ce que on retrouve une complémentarité de bases entre les deux ? (=est ce que elles vont pouvoir coller entre elle ?) Attention il faut bien que les brins complémentaires que tu trouvent soient antiparallèles. Si tu as des brins complémentaires mais que c'est la séquence orienté 5' 3' pour les deux, ça va pas marcher Question 2 : Un promoteur inductif c'est un promoteur qui va pouvoir être activé par quelque chose, ça peut être tout ce que tu veux, du glucose dans l'environnement de la cellule par exemple. Si il y a du glucose le promoteur est activé et on commence la transcription de notre gène en question ! Un gène domestique est un gène qui s'exprime dans toutes les cellules et qui assure les fonctions indispensables à la vie de la cellule. Du coup ça me parait bizarre qu'il soit induit par un promoteur inductif Ca voudrait dire que il ne s'exprime pas tout le temps... Mais bon pourquoi pas, je connais pas tous les gènes domestiques haha Question 3 : Codon d'initiation de la transcription. En fait ton ADNc c'est le complémentaire d'un ADN messager mature. La traduction ne commence pas à la base 1 de l'arn, elle commence au signal d'initiation de la traduction, un peu après Question 4 : Je suis pas sure pour celle là mais je dirais que c'est mieux de prendre juste ECOR1 parce que en coupant juste à coté du codon stop tu peux louper des infos capitales. Après le codons stop on a toujours le signal de poly adénilation par exemple et ça serait bête de le découper. L'arn messager serait moins stable.... Question 5 : Le NGS utilise une technique de fluorescence, on voit les bases associées à des couleurs et c'est comme ça qu'on peut séquencer. La machine prend des photos à chaque fois et ensuite analyse les photos une à une pour associer chaque couleurs à une lettre. Elle nous donne ensuite une suite de lettre Peut être que l'image va t'aider Edited March 3, 2021 by Marin Quote
Marin Posted March 3, 2021 Posted March 3, 2021 Question 6 : On sait pas, pour moi il faut plus d'infos Quote
Marin Posted March 3, 2021 Posted March 3, 2021 Pour toutes tes autres questions je pense que je vais essayer de t'expliquer comment se passe la transgénèse additive et la transgénèse par recombinaison homologue. On commence par la transgénèse additive parce que c'est la plus simple. On va avoir un embryon très très jeune, genre une cellule. On va prendre une pipette et faire une micro injection de milliers de transgènes dans le pronucléus mâle. Et puis c'est tout, pas de crisp cas 9, pas de constructions géniques spéciales.... Puis quelques semaines plus tard seulement 10% des souris naissent en ayant intégré le transgène. Retiens pas le chiffre c'est juste manière de dire que il y en a pas beaucoup. Et en plus on sait pas du tout où il va se placer... La transgénèse par recombinaison homologue c'est bien plus compliqué. On va prendre une construction génique un peu compliqué avec des gènes neo et Tk (Pour les sélectionner après) et puis on va utiliser crisp cas 9 pour introduire le vecteur précisément là ou on veut. On va souvent utiliser un ADN similaire à l'ADN cible, parce que c'est lui qu'on veut innactiver / modifier et donc si il a une séquence similaire il va pouvoir s'hybrider exactement au même endroit. Il faut pour les deux techniques avoir un ADN linéaire, si il est cyclisé et qu'on peut pas le modifier c'est pas possible d'hybrider ses extrémités (puisque il n'a pas d'extrémités). Je sais pas si c'est très clair, j'ai peut être pas tout expliqué donc n'hésites pas si il y a encore des zones de flou ! Il y a 4 heures, lorinne a dit : par rapport à la méthode de séquençage selon sanger, pourquoi elle nécessite l'hybridation d'une amorce ADN en 3' du brin matrice et pas 5'? *est-ce que la seule différence qu'il y a entre un séquençage automatique et un séquençage classique c'est que dans le séquençage automatique on met les 4 ddNTP dans le même tube réactionnel ? Il y a 4 heures, lorinne a dit : pourquoi la RTPCR ne permet pas de sélectionner les animaux transgénique ? Et pour ça je bloque désolée... Quote
Aligot Posted March 3, 2021 Posted March 3, 2021 (edited) Yooo je vais essayer d'aider mon collègue @Marin face à cette montagne de questions Il y a 4 heures, lorinne a dit : *est-ce que la seule différence qu'il y a entre un séquençage automatique et un séquençage classique c'est que dans le séquençage automatique on met les 4 ddNTP dans le même tube réactionnel ? Exactement ! Dans le séquençage moderne (aka l'automatique), tu n'as pas besoin de faire 4 réactions différentes, mais 1 seule et dans 1 seul tube !! En fait on met tout ensemble et les ddXTP vont être fluorescents (chacun d'une couleur différente). Tu fais une électrophorèse capillaire ensuite, une caméra CDD détecte la couleur et l'ordinateur déduit la séquence. C'est ça le séquençage automatique ! Il y a 4 heures, lorinne a dit : *est-ce que qqn peut me donner les différences fondamentales entre transgenese additive et transgenese par recombinaison ? Alors : Transgénèse ADDITIVE : tu ajoutes un gène aléatoirement dans le génome. Tu augmentes ainsi la taille du génome (addition). Par contre tu ne maitrises absolument pas le site d'insertion, on sait qu'il va s'insérer dans le génome mais on ne sait pas où exactement ! Tu vas accoupler une souris femelle avec une souris male. Tu récupères par la suite les œufs fécondés de la femelle. Tu modifies génétiquement ces ovules puis tu les injecte chez une souris pseudo gestante (receveuse). DONC LE TRANSGENE SERA PRESENT DANS TOUTES LES CELLULES. Plus tard naissent les bébés souris et pour vérifier que certains d'entre eux sont transgéniques, tu fais une biopsie de leur queue et tu détectes le transgène par PCR. On accouplera ainsi ceux qui possèdent le transgène avec une femelle non transgénique pour obtenir à la fin une lignée transgénique (ça dure 6,7 mois..) Tu vois ici que tu n'as pas besoin d'une sélection par un antibiotique pour ce type de transgénèse, ni de cellules souches embryonnaires (CES) !! Transgénèse par RECOMBINAISON : Ici tu remplaces un gène. Tu n'ajoutes rien, tu remplaces juste. C'est extrêmement à la mode, et on connait l'endroit de l'insertion dans ce cas là. La manière de faire cette transgénèse par recombinaison est différente selon la cellule que l'on utilise. Ici tu récupères les cellules souches embryonnaires (CES) du blastocyste d'une femelle fécondée. Quand on les modifiera, PAS TOUTES LES CELLULES AURONT LE TRANSGENE (car ce ne sont pas des cellules germinales). On les met en culture, on les modifie génétiquement. On les met ensuite dans un milieu avec un antibiotique pour sélectionner les cellules qui ont le transgène et éliminer les autres ! On insère ensuite les cellules génétiquement modifiées dans le blastocyste d'une souris pseudo gestante et tu obtins des souriceaux chimères. Est-ce que déjà ça c'est plus clair ? Ah beh je vois que le poisson clown a été plus rapide pour la transgénèse Edited March 3, 2021 by Aligot Chat_du_Cheshire 1 Quote
Aligot Posted March 3, 2021 Posted March 3, 2021 Il y a 5 heures, lorinne a dit : *pourquoi la RTPCR ne permet pas de sélectionner les animaux transgénique ? Et pour celle là non elle ne le permet pas, ça n'a rien à voir avec les animaux transgéniques ! Pour les animaux transgéniques tu penses à la transgénèse additive ou par recombinaison that's it ! Ici la RTPCR elle consiste juste en une analyse quantitative de l'ARNm, tu vois vrmt que ça n'a rien à voir. Bonne journée ! Quote
lorinne Posted March 4, 2021 Author Posted March 4, 2021 @Aligot@Marinmille coeurs sur vous ! merci beaucoup pour toutes vos explications Aligot 1 Quote
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