Séquençage Sanger - Exo du cours

[Sitra]

Bonsoir,

 

Dans le cours de notre bien-aimée Bettina sur le séquençage de Sanger, le petit exercice proposé comporte la séquence suivante : "sachant que l'on ne peut séquencer que 300pb par réaction, proposer une stratégie pour poursuivre la séquence sur la totalité du fragment". Sachant que "on possède un fragment d'ADN de 1,5kb dans un plasmide aux sites EcoR1 et Hind III".

 

On cherche donc à séquencer les 1,5kb, donc est-ce qu'une stratégie serait de faire un premier séquençage avec première amorce en 5', puis une fois que l'on a récupérer la séquence, réitérer l'expérience mais en utilisant une seconde amorce correspondant à la fin de la première séquence et ainsi de suite... Pour à la fin mettre les séquences bout à bout ?

 

Illustration professionnelle : Amorce 1 (5' ATCGT) + ddXTP = séquence 1 (5' ATCGT...ACGGT 3') --> amorce 2 (5' ACGGT) + ddXTP = séquence 2 (5' ACGGT...TTATGC 3'), etc...

 

Merci

[Paul__onium]

@Sitra (the warrior ^^) il faut couper poto, cherche pas de midi à 14h . Tu obtiens ainsi des fragments  de petites tailles que tu peux analyser.

[Sitra]

Il y a 11 heures, Paul__onium a dit :

cherche pas de midi à 14h 

Si tes cas cliniques du soir avaient pas été tirés par les cheveux au 1er semestre aussi 

 

Mais je comprends pas, tu peux pas couper n'importe où comme tu veux ton fragment ? Même en isolant ton fragment par EcoR1 et en y collant des endonucléases, c'est pas trop aléatoire ? 

[Paul__onium]

il y a 40 minutes, Sitra a dit :

Mais je comprends pas, tu peux pas couper n'importe où comme tu veux ton fragment ? Même en isolant ton fragment par EcoR1 et en y collant des endonucléases, c'est pas trop aléatoire ? 

On ne coupe pas n'importe où en effet. Lorsqu'on a recours à cette technique, on connait déjà l'emplacement des différents sites ainsi que la taille des fragments apres coupure. Utiliser des endonucléases signifie perdre une partie de la séquence d'intérêt.

 

Donc dans le cas de ton plasmide à 1,5kb, il faut éssayer de le couper avec les enzymes de restriction afin d'avoir des fragments de moins de 300pb qu'on pourra analyser. A la fin on rassemble tout.