sequençage de l'ADN de sanger

[Oce11]

Bonjour à tous et bonne année

Je me demander si quelqu'un aurait compris le sequençage  de l'ADN de sanger  et pourrais me l'expliquer je n'arrive pas a faire cette exo

 

exo UE11 .pdf

[Croziflette_Claquette]

Salut!

Je te met des posts ou j'ai essayé d'expliquer déjà ! 

Essaie de voir si tu comprends avec ça! Sinon dis moi le

 

 

[Sarhabdomyocyte]

Coucou !!

 

Je viens dépanner hihi

 

 

Alors premièrement le principe d’un séquençage ça va être de déterminer l’enchaînement des nucléotides d’un brin d’ADN de 3’ vers 5’. 

 

Dans la méthode de Sanger, on va utiliser ce qu’on appelle des 2’,3’-didésoxyNucléotides (ddNTP), c’est à dire des nucléotides qui ont perdu leur atome d’oxygène en position 2’ et 3’. Cela va rendre impossible la création d’une liaison phosphodiester avec un autre nucléotide.

 

Pour appliquer la méthode, on met dans un tube à essai la séquence d’ADN simple brin à séquencer, en présence d’une amorce avec laquelle elle s’apparie et de désoxynucléotides (dNTP) « ordinaires » ET de ddNTP en petite proportion. On y ajoute une ADN polymérase, qui à partir de l’amorce va synthétiser le brin complémentaire du brin modèle en utilisant les dNTP qu’elle trouve à sa portée. Comme les dNTP sont plus nombreux dans le tube à essai que les ddNTP, la polymérase va plus souvent en utiliser. Mais à certains moments elle tombera sur un ddNTP, et là la synthèse s’arrêtera après l’ajout de ce ddNTP puisqu’il est impossible d’ajouter un autre nucléotide ensuite par liaison phosphodiester !!

 

Comme le hasard fait bien les choses, on va se retrouver à la fin dans le tube à essai avec différents brins synthétisés. En effet, la synthèse se sera arrêtée à des stades différents pour chaque brin, cela dépendant du premier ddNTP que l’ADNpol en question aura incorporé. Par exemple, il y aura dans ton tube un brin qui comportera une seule base (cas où le premier nucléotide inséré s’avère être un ddNTP) et un tube qui en comportera, mettons, 300 (cas où le 300e nucléotide inséré est un ddNTP).

Les fragments synthétisés auront donc tous une taille différente.

 

 

Mais ce que je ne t’ai pas dit ( ), c’est que cette expérience se déroule en fait dans 4 tubes à essai différents : chacun contient un seul et unique type de ddNTP (par exemple le premier tube des ddATP, le deuxième ddTTP etc). 

A la fin de l’expérience, on se munit d’un gel d’électrophorèse très résolutif et on fait migrer séparément les contenus des 4 tubes à essai (les fragments sont marqués par radiographie au niveau de l’amorce). 

Sur le schéma de ton exercice, tu vois par exemple qu’on a fait migrer à gauche le contenu des tubes dans lesquels on avait mis les ddATP.

 

Les fragments ayant tous des tailles différentes, ils migrent à des hauteurs différentes (le fragment de plus petite taille migre le plus loin). Or plus le fragment est de petite taille, plus le ddNTP inséré est vers 3’ car inséré précocément !!

Ainsi, tu peux en déduire l’enchaînement des nucléotides. En effet, il te suffit de lire l’ordre des ddNTP insérés du plus petit fragment vers le plus gros fragment, c’est à dire de 3’ vers 5’. En effet, ces ddNTP se sont insérés à ces endroits de la séquence car ils étaient complémentaires du brin matrice, donc si on les lit dans l’ordre ils formeront cette séquence complémentaire.

 

 

Je t’ai expliqué en détail ici pour que tu comprennes, mais je pense qu’on attend de toi un résumé dans l’exercice ! Si tu n’as toujours pas compris, essaie de me relire en faisant un schéma du processus de synthèse des brins, puis de l’électrophorèse. Une fois que tu as compris la logique, ça paraît tout simple tu verras.

J’espère que c’est plus clair, sinon dis le moi surtout

 

Bon courage  

 

Ok génial j’ai écrit mon pavé pour rien ahah @Croziflette_Claquette 

[Croziflette_Claquette]

il y a 5 minutes, Sarhabdomyocyte a dit :

 

Ok génial j’ai écrit mon pavé pour rien ahah @Croziflette_Claquette 

Maiiis nooon je suis persuadé que ca servira pour certaines personnes, c'est expliqué différemment et très bien!

[Oce11]

Le 05/01/2021 à 23:37, Sarhabdomyocyte a dit :

Coucou !!

 

Je viens dépanner hihi

 

 

Alors premièrement le principe d’un séquençage ça va être de déterminer l’enchaînement des nucléotides d’un brin d’ADN de 3’ vers 5’. 

 

Dans la méthode de Sanger, on va utiliser ce qu’on appelle des 2’,3’-didésoxyNucléotides (ddNTP), c’est à dire des nucléotides qui ont perdu leur atome d’oxygène en position 2’ et 3’. Cela va rendre impossible la création d’une liaison phosphodiester avec un autre nucléotide.

 

Pour appliquer la méthode, on met dans un tube à essai la séquence d’ADN simple brin à séquencer, en présence d’une amorce avec laquelle elle s’apparie et de désoxynucléotides (dNTP) « ordinaires » ET de ddNTP en petite proportion. On y ajoute une ADN polymérase, qui à partir de l’amorce va synthétiser le brin complémentaire du brin modèle en utilisant les dNTP qu’elle trouve à sa portée. Comme les dNTP sont plus nombreux dans le tube à essai que les ddNTP, la polymérase va plus souvent en utiliser. Mais à certains moments elle tombera sur un ddNTP, et là la synthèse s’arrêtera après l’ajout de ce ddNTP puisqu’il est impossible d’ajouter un autre nucléotide ensuite par liaison phosphodiester !!

 

Comme le hasard fait bien les choses, on va se retrouver à la fin dans le tube à essai avec différents brins synthétisés. En effet, la synthèse se sera arrêtée à des stades différents pour chaque brin, cela dépendant du premier ddNTP que l’ADNpol en question aura incorporé. Par exemple, il y aura dans ton tube un brin qui comportera une seule base (cas où le premier nucléotide inséré s’avère être un ddNTP) et un tube qui en comportera, mettons, 300 (cas où le 300e nucléotide inséré est un ddNTP).

Les fragments synthétisés auront donc tous une taille différente.

 

 

Mais ce que je ne t’ai pas dit ( ), c’est que cette expérience se déroule en fait dans 4 tubes à essai différents : chacun contient un seul et unique type de ddNTP (par exemple le premier tube des ddATP, le deuxième ddTTP etc). 

A la fin de l’expérience, on se munit d’un gel d’électrophorèse très résolutif et on fait migrer séparément les contenus des 4 tubes à essai (les fragments sont marqués par radiographie au niveau de l’amorce). 

Sur le schéma de ton exercice, tu vois par exemple qu’on a fait migrer à gauche le contenu des tubes dans lesquels on avait mis les ddATP.

 

Les fragments ayant tous des tailles différentes, ils migrent à des hauteurs différentes (le fragment de plus petite taille migre le plus loin). Or plus le fragment est de petite taille, plus le ddNTP inséré est vers 3’ car inséré précocément !!

Ainsi, tu peux en déduire l’enchaînement des nucléotides. En effet, il te suffit de lire l’ordre des ddNTP insérés du plus petit fragment vers le plus gros fragment, c’est à dire de 3’ vers 5’. En effet, ces ddNTP se sont insérés à ces endroits de la séquence car ils étaient complémentaires du brin matrice, donc si on les lit dans l’ordre ils formeront cette séquence complémentaire.

 

 

Je t’ai expliqué en détail ici pour que tu comprennes, mais je pense qu’on attend de toi un résumé dans l’exercice ! Si tu n’as toujours pas compris, essaie de me relire en faisant un schéma du processus de synthèse des brins, puis de l’électrophorèse. Une fois que tu as compris la logique, ça paraît tout simple tu verras.

J’espère que c’est plus clair, sinon dis le moi surtout

 

Bon courage  

 

Ok génial j’ai écrit mon pavé pour rien ahah @Croziflette_Claquette 

Merci bcp pour l aide desole de ma réponse tardive