Séquençage Sanger

[Crouz]

Bonjour

Pour la méthode de séquençage selon Sanger, pourquoi est-ce que l'on interrompt au hasard l'élongation grâce à nos ddXTP ?

Ensuite, lorsqu'on obtient nos 4 tubes, est-ce qu'on les mélange pour n'en former plus qu'un que l'on étudie par électrophorèse ?

Enfin, si dans un exercice on nous donne le schéma du résultat d'une électrophorèse, elle correspond bien à un seul fragment ?

Voilà haha, si quelqu'un peut m'éclairer, merci d'avance !

[Croziflette_Claquette]

Salut!

Alors non justement les 4 tubes c'est important qu'ils soient séparés. Dans chaque tube on va mettre les dXTP et 1 seul ddXTP (ddATP dans le tube 1, ddGTP dans le tube 2...).

Ainsi, les ddXTP si ils sont incorporés dans l'élongation ils vont l’arrêter parce qu'ils ont plus l'hydroxyle en 3' qui permet d'ajouter des nucléotides derrière lui. Donc ça tronque le morceau qui est en train d'être élonger.

Alors, dans le tube 1 par exemple où on a tous les dXTP mais aussi du ddATP, dès que tu vas avoir besoin de mettre un nucléotide ATP tu auras 2 possibilités :

- Soit c'est un dATP qui est mis et le fragment continue de s'alonger

- Soit c'est un ddATP qui est mis et le fragment s'arrête et a une taille propre.

Ainsi dans chaque tube tu auras pleins de petit fragments de pleins de tailles (à chaque G dans la séquence dans le tube du ddGTP, une nouvelle taille).

Ensuite tu vas faire migrer chaque tube sur une ligne d'électrophorèse et séparer ces fragments en fonction de leur taille.

 

Pour l'interpréter :

Le plus petit morceau sera de 1 nucléotide, il aura migré le plus loin, si il est sur la piste A, alors le premier nucléotide de la séquence sera un ATP (il a été incorporé un ddATP qui a arrêter l'élongation à 1seul nucléotide). Ensuite le 2eme fragment aura 2 nucléotide, l'ATP suivi de par exemple un ddGTP s'il est sur la ligne G. Ce fragment aura migré alors un petit peu moins loin. Et donc en remontant la lecture tu vas pouvoir trouver la séquence : ici dans mon exemple elle commencerait par 5' AG.....3'.

Prenons cette photo.

Sur l'électrophorèse en jaune, la séquence sera 5' GATTTACGCGTCG3' de bas en haut.

 

Donc sur l'électrophorèse en fait c'est une infinité de petits fragments qui ont été arrêtés à différentes tailles en fonction de la séquence et pas un seul.

 

Est-ce que ça t’éclaircis ou pas?

N'hésite pas à poser des questions sur le mécanisme. A travers le forum c'est pas évident de tout expliquer sans schèma....

[lilythium]

bonjour !

je m'incruste pcq je n'ai pas non plus très bien compris !

comment on peut avoir plusieurs fragments si l'élongation s'arrête à cause du ddXTP ?

[Ilyatrogène]

@Croziflette_Claquette re-salut, je m'incruste dans cette discussion parce qu'il y a un point que j'ai pas bien compris; si il y a un trait dans la colonne du A mais qu'il n'est pas tout en bas, ça signifie que ce fragment finit par un ddATP mais possède tous les dXTP ou bien il finit par un ddATP mais en plus de ça il possède plus de dATP voir que ça ?

 

Et donc un séquençage c'est la suite de plusieurs fragments en fonction du nucléotide par lequel ils finissent et non juste un enchainement de 1 nucléotide (A,T,C ou G)? 

[Croziflette_Claquette]

Salut à tous!

Normal que cette technique soit compliquée à comprendre. Je vais essayer de répondre a vos questions en faisant une réponse avec des schèmas, j'arrive!

 

[Crouz]

D'accord !!

Donc au final le but va être de synthétiser une multitude de petits fragments qui selon leurs tailles vont migrer plus ou moins loin sur le gel et nous permettre de reconstituer la séquence du brins d'ADN initiale que l'on veut étudier ? En réalité ce qui apparaît sur le gel c'est la fin du fragment stopper par exemple si il provient du tube 1 par un ddATP ce qui correspond donc à A ?

Merci de ton explication

[lilythium]

jsuis morte comment on n'est tous en galère jpp

[Croziflette_Claquette]

il y a 5 minutes, Crouz a dit :

D'accord !!

Donc au final le but va être de synthétiser une multitude de petits fragments qui selon leurs tailles vont migrer plus ou moins loin sur le gel et nous permettre de reconstituer la séquence du brins d'ADN initiale que l'on veut étudier ? En réalité ce qui apparaît sur le gel c'est la fin du fragment stopper par exemple si il provient du tube 1 par un ddATP ce qui correspond donc à A ?

Merci de ton explication

C'est exactement ça!

J'arrive pour plus de détails

[Croziflette_Claquette]

il y a 34 minutes, lilythium a dit :

bonjour !

je m'incruste pcq je n'ai pas non plus très bien compris !

comment on peut avoir plusieurs fragments si l'élongation s'arrête à cause du ddXTP ?

Ce qui est important c'est que dans chaque tubes tu as aussi tous les dXTP utile à une réplication normale. Donc oui soit ça s'arrête direct pour certains fragments avec un ddATP par exemple, soit c'est un dATP qui est mis et ça continue, ça s'arrêtera plus loin au prochain A. N'oubliez pas que c'est une réaction en chaîne, on crée pleins de fragments, pas que 1seul! Donc dans chaque tube on a des fragments coupés à différents endroits en plusieurs nombres (heuresement sinon on les verrai pas en électrophorèse).

il y a 38 minutes, Ilyana31 a dit :

Et donc un séquençage c'est la suite de plusieurs fragments en fonction du nucléotide par lequel ils finissent et non juste un enchainement de 1 nucléotide (A,T,C ou G)?

Oui!! A chaque fois on a des fragments un peu plus long, seul le premier n'aura que un seul nucléotide!

 

Voici un exemple qui arrive, peut-être que ce sera plus clair!

J'ai pris une séquence double brin en haut. J'y ai mis une amorce en rouge pour séquencer au delà de l'amorce.

Chaque tube possède des dATP, dGTP, dCTP, dTTP, mais chacun possède en plus soit des ddATP (1), soit des ddGTP (2) soit des ddCTP (3), soit des ddTTP (4).

Dans chaque tube on va donc allonger. En premier va falloir mettre un C en face du G, puis un A en face du T, puis un T....

2choix dans chaque tube :

- Soit c'est un dXTP qui est mis et le fragment continue de s'allonger jusqu'à la prochaine même lettre

- Soit c'est un ddXTP qui est mis, le fragment s'arrête, mesure une taille précise.

Ainsi dans chaque tube on a plusieurs type de fragments en grande quantité.

Le tube 1,3 et 4 ont 3 fragments de tailles différentes, le tube 2 a 1 seul fragment.

 

On fait ensuite migrer le tout par électrophorèse. Les fragments les plus courts migreront le plus, ils seront en bas!

Et ainsi on lis de bas en haut la séquence qui est celle de 5' en 3', soit celle du brin sens (brin du bas sur ma séquence en haut de la page).

Est-ce que ça va un peu mieux?

[Crouz]

C'est super ! Tout est beaucoup plus clair merci beaucoup d'avoir pris le temps

Bonne soirée !

[Croziflette_Claquette]

il y a 2 minutes, Crouz a dit :

C'est super ! Tout est beaucoup plus clair merci beaucoup d'avoir pris le temps

Bonne soirée !

Avec grand plaisir !!

[lilythium]

Il y a 5 heures, Croziflette_Claquette a dit :

Est-ce que ça va un peu mieux?

C'est beaucoup mieux ! Je ne suis pas sûre d'avoir tout tout tout cerné, mais je suis sur la bonne voie merci :))

 

Petite question encore oups : du coup ça veut dire qu'il y a autant de "places" sur l'éléctrophorèse que de nucléotides après l'amorce dans la séquence ?

Edited January 5, 2021 by lilythium

[Ilyatrogène]

@Croziflette_Claquette merci je comprends mieux !

[Croziflette_Claquette]

Il y a 1 heure, lilythium a dit :

C'est beaucoup mieux ! Je ne suis pas sûre d'avoir tout tout tout cerné, mais je suis sur la bonne voie merci :))

Petite question encore oups : du coup ça veut dire qu'il y a autant de "places" sur l'éléctrophorèse que de nucléotides après l'amorce dans la séquence ?

Du coup oui! Chaque bande de l'electrophorese correspond à une taille de fragment et y a une taille de fragment différente à chaque nucléotides. Donc si au total tu vois 156 bandes, tu as séquence 156 nucléotides ! 

Ouiii tqt pas t'es sur la bonne voie, tout vas s'éclaircir avec la suite!

[lilythium]

@Croziflette_Claquette okay merci beaucoup !!

[Oce11]

Le 05/01/2021 à 15:41, Croziflette_Claquette a dit :

Salut!

Alors non justement les 4 tubes c'est important qu'ils soient séparés. Dans chaque tube on va mettre les dXTP et 1 seul ddXTP (ddATP dans le tube 1, ddGTP dans le tube 2...).

Ainsi, les ddXTP si ils sont incorporés dans l'élongation ils vont l’arrêter parce qu'ils ont plus l'hydroxyle en 3' qui permet d'ajouter des nucléotides derrière lui. Donc ça tronque le morceau qui est en train d'être élonger.

Alors, dans le tube 1 par exemple où on a tous les dXTP mais aussi du ddATP, dès que tu vas avoir besoin de mettre un nucléotide ATP tu auras 2 possibilités :

- Soit c'est un dATP qui est mis et le fragment continue de s'alonger

- Soit c'est un ddATP qui est mis et le fragment s'arrête et a une taille propre.

Ainsi dans chaque tube tu auras pleins de petit fragments de pleins de tailles (à chaque G dans la séquence dans le tube du ddGTP, une nouvelle taille).

Ensuite tu vas faire migrer chaque tube sur une ligne d'électrophorèse et séparer ces fragments en fonction de leur taille.

 

Pour l'interpréter :

Le plus petit morceau sera de 1 nucléotide, il aura migré le plus loin, si il est sur la piste A, alors le premier nucléotide de la séquence sera un ATP (il a été incorporé un ddATP qui a arrêter l'élongation à 1seul nucléotide). Ensuite le 2eme fragment aura 2 nucléotide, l'ATP suivi de par exemple un ddGTP s'il est sur la ligne G. Ce fragment aura migré alors un petit peu moins loin. Et donc en remontant la lecture tu vas pouvoir trouver la séquence : ici dans mon exemple elle commencerait par 5' AG.....3'.

Prenons cette photo.

Sur l'électrophorèse en jaune, la séquence sera 5' GATTTACGCGTCG3' de bas en haut.

 

Donc sur l'électrophorèse en fait c'est une infinité de petits fragments qui ont été arrêtés à différentes tailles en fonction de la séquence et pas un seul.

 

Est-ce que ça t’éclaircis ou pas?

N'hésite pas à poser des questions sur le mécanisme. A travers le forum c'est pas évident de tout expliquer sans 

 

Le 05/01/2021 à 16:30, Croziflette_Claquette a dit :

Ce qui est important c'est que dans chaque tubes tu as aussi tous les dXTP utile à une réplication normale. Donc oui soit ça s'arrête direct pour certains fragments avec un ddATP par exemple, soit c'est un dATP qui est mis et ça continue, ça s'arrêtera plus loin au prochain A. N'oubliez pas que c'est une réaction en chaîne, on crée pleins de fragments, pas que 1seul! Donc dans chaque tube on a des fragments coupés à différents endroits en plusieurs nombres (heuresement sinon on les verrai pas en électrophorèse).

Oui!! A chaque fois on a des fragments un peu plus long, seul le premier n'aura que un seul nucléotide!

 

Voici un exemple qui arrive, peut-être que ce sera plus clair!

J'ai pris une séquence double brin en haut. J'y ai mis une amorce en rouge pour séquencer au delà de l'amorce.

Chaque tube possède des dATP, dGTP, dCTP, dTTP, mais chacun possède en plus soit des ddATP (1), soit des ddGTP (2) soit des ddCTP (3), soit des ddTTP (4).

Dans chaque tube on va donc allonger. En premier va falloir mettre un C en face du G, puis un A en face du T, puis un T....

2choix dans chaque tube :

- Soit c'est un dXTP qui est mis et le fragment continue de s'allonger jusqu'à la prochaine même lettre

- Soit c'est un ddXTP qui est mis, le fragment s'arrête, mesure une taille précise.

Ainsi dans chaque tube on a plusieurs type de fragments en grande quantité.

Le tube 1,3 et 4 ont 3 fragments de tailles différentes, le tube 2 a 1 seul fragment.

 

On fait ensuite migrer le tout par électrophorèse. Les fragments les plus courts migreront le plus, ils seront en bas!

Et ainsi on lis de bas en haut la séquence qui est celle de 5' en 3', soit celle du brin sens (brin du bas sur ma séquence en haut de la page).

Est-ce que ça va un peu mieux?

Merci bcp pour l aide 

Edited January 7, 2021 by Oce11