PCR langin à l'aide

[lanoradrenaline_auski]

salut todo el mundo, est ce que quelqu'un aurait la gentillesse de me faire un point PCR classique vs PCR quantitative parce que je suis pas tres au point sur ce sujet ( pas au point = je comprends R ) ... J'espère que c'est pas trop long à faire , je besoin juste des points essentiels. 

 

( j'ai déjà cherchée des sujets sur ce point j'ai pas trouvée ) 

 

Merci bcp d'avance 

[audreyfdn]

Coucou !

Le principe de la PCR est d'amplifier des séquences d'ADN que l'on veut étudier. 

Pour cela, il y a plusieurs étapes. Tout d'abord tu vas extraire ton ADN de tes cellules. Puis tu dénatures cet ADN, tu mets tes amorces qui vont s'hybrider de façon spécifique à une portion d'ADN.

Ensuite, la réplication de tes brins d'ADN va se faire grâce à une Taq Polymérase, qui est une polymérase thermorésistante. Puisque dans la PCR tu n'utilises pas d'enzymes qui permettent de garder l'ADN dénaturé, on doit être à une température assez élevé pour que tes deux brins d'ADN restent dénaturé, mais à une température assez faible, pour que il y ai une hybridation entre les anciens brins et les brins néosynthétisé par la Taq Polymérase (d'où la température à 72 °C). 

La seule portion d'ADN qui va être répliqué/ amplifié est la portion entre tes amorces. 

 

Après un certain nombre de cycle de réplications, tu vas transférer tes résultats sur gel d'électrophorèse. Sur ce gel, les brins d'ADN vont migrer en fonction de leurs poids moléculaires, donc ça te permet d'étudier la taille des portions d'ADN qui ont été répliqués. 

Cela te permet d'étudier des délétions de nucléotides (tu pensais te retrouver avec 120pb, au final tu en as 80...), des amplifications ou des additions de nucléotides (tu pensais tu retrouver avec 120pb tu te retrouves avec 300...). Si tu as eu aucunes amplifications, cela veut dire que tes amorces ne se sont pas hybridés donc qu'il y a eu mutations dans la régions ou l'amorce aurait dû s'hybrider...

Donc la PCR te permet d'étudier pleins de choses !

La PCR peut aussi se faire sur les ARNm. On extrait les ARN, puis on fait une reverse transcription pour avoir de l'ADN à la place de l'ARN, et on on fait toutes les étapes citées au dessus 

 

Maintenant venons en à la PCR ou RT PCR (RT pour reverse transcription). 

En gros ça va être le même principe. On fait les mêmes étapes que la PCR classique, mais à la seule différence qu'ici on ne cherche pas à étudier qualitativement l'ADN, c'est à dire à savoir combien une portion d'ADN à de paire de base, mais on cherche à étudier quantitativement l'ADN. 

Et pour se faire, on va introduire dans notre milieu en plus des amorces, en plus de la taq poylmérase, une petite protéine qui s'appelle CYBR green, et qui, lorsqu'elle est intégrée entre les nucléotides de l'ADN, va fluorescer. 

Avec un appareil de mesure, on va étudier la fluorescence en fonction de la quantité d'ADN. 

Plus tu vas avoir de l'ADN amplifié, plus cela va fluorescer. L'appareil a un certain seuil de fluorescence. Il faut donc atteindre une certaine quantité d'ADN pour que l'appareil puisse détecter la fluorescence. Ce seuil à atteindre est important ! en fonction de la quantité d'ADN que tu avais au départ, le seuil sera atteint plus rapidement. 

Quand tu veux étudier l'expression d'un gène entre deux cellules, tu vas pouvoir comparer le taux d'ARNm qu'il y avait dans les deux cellules au départ grâce à la RT PCR quantitative. Plus ce seuil de détection est atteint rapidement, plus tu avais de l'ARNm dans ta cellule au départ, donc le gène était exprimée davantage. 

 

Est ce que c'est tout clair pour toi ? Si tu veux que je revienne sur certains points n'hésite pas !

 

 

[lanoradrenaline_auski]

Wouww , merci x1000000 pour cette réponse !!! @audreyfdn tu viens de me faire une fiche incroyable !!