FowlMax Posted March 1, 2015 Posted March 1, 2015 Bonjour, Alors je n'ai pas tout à fait saisis les différentes nuances des "manipulations" dans les QCM de recherche partie Levade (sûrement simple, mais j'ai du mal à visualiser pour le moment). A chaque question qui demande de déterminer si l'on peut insérer dans les 2 sens, je me retrouve à ne pas comprend réellement sur quoi me base ? Pareil lorsque je dois savoir si tel insert coupé par x et y, pourra s'insérer dans tel plasmide digéré par z dans les deux sens. Par exemple, si on pose : Taq1 : 5' T/CGA 3' Cla1 : 5' AT/CGAT 3' Acc1 : 5' GT/CGAC 3' Le cDNA représenté comme ceci : ----Cla1---ATG-------------Stop----Acc1 Et un plasmide contenant un seul site Taq1. Quelle est la démarche pour visualiser les possibilités de combinaisons ? Je pensais faire comme ceci : cDNA : 5' T/CGA ....................G..... ......T....................CAGC/TG 5' en plaçant de chaque côté les sites Cla1 et Acc1, mais même à partir de là, je ne visualise pas plus que ça. Quelqu'un pourrait donc m'expliquer son raisonnement face à ce type d'exercice ? Autre chose : Lorsque dans une expérience, on parle de conditions optimales, on écarte donc la possibilité que le plasmide se referme sans avoir intégré d'insert ? Car dans un QCM de TD, à l'item "Le plasmide ne peut pas se refermer sur lui-même", j'ai noté vrai, mais à part le terme "conditions optimales" il n'y a pas de précisions sur une éventuelle phosphatase ? Merci d'avance
Solution HansHubberform Posted March 7, 2015 Solution Posted March 7, 2015 Hola, Désolé pour le retard déja :/ Pour savoir dans quel/combien de sens s'insère un insert j'utilise cette méthode pour savoir quels sont les bouts libres : Je mets une barre (en pointillés si tu veux), à distance équivalente des deux cotés, ce qui est au milieu donnera l'extremité libre Taq1 : 5' T/CGA 3' : la barre est à une base du début, elle sera à une base de la fin Taq1 : 5' T/CG/A 3' Bouts libres TaqI : CG Cla1 : 5' AT/CGAT 3' barre est à 2 bases du début, elle sera à 2 bases de la fin Cla1 : 5' AT/CG/AT 3' Acc1 : 5' GT/CGAC 3' même chose, ici l'extremité libre sera 5 CG 3 Les 3 enzymes ont les memes extremités libres, donc en les utilisant on pourra avoir l'insertion de l'insert et dans ce cas dans les deux sens (cla aci et tacI utilisés) Ca c'est l'exemple de 2 sens : 5' GC 3' se lie a 3' CG 5' et pareil de l'autre coté. ________ maintenant, si jamais les 2 extremités de ton insert sont differentes, alors il ne pourra s'inserer que d'un coté. exemple (en considerant qu'il y ait les sites) : Taq1 : 5' T/CGA 3' CG Cla1 : 5' AT/CGAT 3' CG Acc2 : 5' GT/ATAC 3' AT Imagine ton insert coupé par Taq1 et ACc2 Ton plasmide coupé par Acc2 et Cla1 Là, les deux extremites de ton insert sont differentes, AT ne peut pas se lier a CG, mais qu'à AT, donc un seul sens C'est assez compliqué de voir ça au début mais une fois compris ca devient tres simple j'espere que c'est clair, sinon hésite pas je repasserai si besoin ______ conditions optimales : ne peut se refermer, normalement...parce qu'on est aussi venu me voir avec ce "probleme" de correction, mais je pense que M.levade dès qu'il met optimal considère qu'ils ne peuvent se refermer. PS : CG s'insere avec CG mais pas avec GC, d'ou l'interet de lire la sequence et de ne travailler qu'avec le bout de sequence donné
FowlMax Posted March 15, 2015 Author Posted March 15, 2015 Désolé pour ma réponse tardive aussi, j'ai été assez occupé par d'autres matières entre temps, et je n'ai pas eu l'occasion de me replonger efficacement dedans (oui, car si je lis l'explication sans le bosser en même temps, je ne vais pas retenir je pense ! ) Je bosserais sûrement ça cet aprem, du coup si j'ai des questions, j'ai poserais sûrement ici, mais je trouve ça assez clair comme ça, je visualise un peu mieux déjà ! Merci EDIT : J'ai bel et bien compris, je ferais sûrement d'autres QCM pour confirmer si j'ai bien compris ou non, mais ça me parle déjà mieux ! Après je ne suis pas bien sûr d'avoir réellement compris le "mécanisme", mais en tout cas pour répondre aux qcm ça va Et pour les conditions optimales, il semble que même dans les QCM du TaT il soit précisé "conditions optimales sous entend la présence d'une phosphatase alcaline, du coup j'imagine que Mr. Levade y a déjà répondu un jour.
mpages9 Posted March 21, 2015 Posted March 21, 2015 Salut HansHubberForm , merci pour cette technique qui va me faire gagner du temps car jusqu'à maintenant, je réécrivais toute les séquences..... Petite question néanmoins: si tu trouves 2 extrémités libre de taille différentes, il me semble que l'insertion n'est pas possible c'est bien ça? exemple: tu coupes ton vecteur avec l'enzyme X (la même des 2 côtés)--> tu trouves l'extrémité libre GCC tu coupes ton plasmide avec l'enzyme Y (la même des 2 côtés)--> tu trouves l'extrémité libre GCCC ---> on ne peut pas insérer. C'est bien ça? Merci et bon weekend!
HansHubberform Posted March 22, 2015 Posted March 22, 2015 Voila, il faut absolument la meme sequence sinon ca ne pourra pas s'insérer (bon après vu que c'est palindromique ca serait plus du genre GAC et GCGC mais bon c'est un peu chipoter la )
mpages9 Posted March 24, 2015 Posted March 24, 2015 Désolée mais dernière question sur le sujet: peut on appliquer ta méthode dans le cas ou on aurait un enzyme de restriction du type: X: 5' GCGCGC|GC '3 c'est à dire qu'on coupe plus proche de l'extrémité terminale?? si oui comment fait on? Désolée c'est peut être du détail, je voudrais juste parer toutes les éventualités pour le jour J:)
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