Sens d'insertion de l'insert et banque de cDNA

[Loulouu]

Bonjour !

 

J'ai trois questions sur le cours de M.Levade :

 

Premièrement, à propos des plasmides, il est sous entendu dans le cours que le sens d'insertion de l'insert dans le plasmide à une importance (par exemple pour l'utilisation des région promotrices T7 ou Sp6, cf image jointe), mais je ne vois pas pourquoi, je ne vois pas ce que ça change et en quoi le choix du promoteur pour exprimer la séquence intégrée en dépend.

 

Deuxièmement, à propos des banques de cDNA, le prof a dit qu'on pourrait isoler du cDNA à partir de transcrits de n'importe quel type cellulaire, même très peu exprimés, en amplifiant alors par RT-PCR, mais on ne le fait pas. Je ne comprends pas pourquoi

 

Et enfin, toujours à propos des banques mais cette fois du criblage par oligonucléotide de synthèse, il est mentionné qu'on peut à la fin du procédé faire un séquençage. Or avant on nous explique qu'on part justement de la séquence du gène qu'on déduit la plus probable à partir de la séquence d'aa de la protéine qu'on veut étudier, pour pouvoir faire une hybridation in situ. Bref je ne vois pas l'intérêt de séquencer alors qu'on connait déjà la séquence ! A moins que ce soit pour être sûr et que ce soit plus précis parce que l'hybridation a pu n'être que partielle ?

 

 

Merci d'avance pour votre aide

[DoraH]

Bonjour Klaralou,

 

- Pour répondre à ta première question, le sens d'insertion de l'insert dans le plasmide va avoir de l'importance lorsqu'il y a un promoteur car si tu te rappelle de tes cours de génome la transcription de ton ADN débute à partir de ton promoteur et donc si l'objectif de ton vecteur recombinant est d'obtenir une protéine particulière il faut respecter le sens de transcription. En effet sans promoteur l'insertion de ton insert n'a pas d'importance.

 

-Pour ta deuxième question, je ne sais pas pourquoi c'est ainsi et je pense qu'il n'est pas nécessaire de t'encombrer l'esprit avec cela. On doit certainement préférer une cellule qui exprime spécifiquement la protéine et donc l'ARNm et donc le cDNA plutôt que l'ensemble des cellules contrairement à la banque d'ADN génomique où peu importe le type cellulaire l'ADN sera le même pour toutes.

 

-Pour ta dernière question, alors tu crée en effet ton oligonucléotide à partir de ta protéine en déduisant la séquence la plus probable mais qui n'est pas exactement ta séquence d'ADN car tu le sais plusieurs codons peuvent coder pour un même AA. Cet oligonucléotide va alors s'hybrider avec plusieurs séquences qui ne seront pas exactement comme la sienne et à ce moment la je pense que le séquençage permet en effet d'avoir une idée de toutes les séquences qui pourraient avoir donné la protéine de départ. c'est comme tu le dis certainement une question de précision..

 

Voilà les réponses que je te propose je ne sais pas si c'est clair, tu peux également tenter de poser ces questions au professeur Levade.

Dora Tutrice Recherche

[Loulouu]

Merci beaucoup pour ta réponse très claire ! 

bonne fin de week end