QCM 29

[loli]

salut tout le monde, j'ai un doute avec ce QCM 29-E qui est comptée vrai. Je vois absolument pas pourquoi ? pour moi, soit les amorces selon l'ancienne séquençage sont marquées, soit les ddNTP avec la séquençage automatisée!

au passage, je voulais vérifier si toutes les amorces/sondes que l'on utilise quelque soit la technique sont fait tjs d'ADN.

portez-vous bien !! 

[Liliputienne]

Bonsoir @loli  

 

La méthode Sanger, est une méthode très utilisée pour étudier le DNA mais en PACES on passe assez peu de temps pour expliquer le processus. Voici donc LA recette de préparation pour un bon Sanger (et quels sont les ingrédients nécessaires) ! 

 

• Pourquoi faire un Sanger ?

Pour étudier le DNA, et sa composition. Autrement dit, cette méthode permet le séquençage du DNA. 

• Comment faire un Sanger ? 

Au tout début tu possèdes du DNA double brin, que tu soumets à haute température afin de le dénaturer et ainsi d'obtenir deux simples brins de DNA.  Ensuite, tu t'équipes de 4 récipients : disons des tubes à essais ! Dans ces derniers tu y mélanges : le DNA simple brin, un primer (amorce), une DNA polymérase de type I (ou fragment de Klenow cela dépend) et des dNTP ainsi qu'UN SEUL ddNTP marqué.  

 

 

Puisque tu as 4 tubes à essais tu y insères dans chacun un ddNTP correspondant à une base : donc un ddATP, ddCTP, ddTTP, ddGTP. 

 

 

L'intérêt réside dans le fait que la DNA polymérase va synthétiser le brin complémentaire jusqu'à tomber sur le ddNTP à incorporer. Dés qu'elle veut l'insérer, cela lui est impossible puisqu'il manque un groupement hydroxyle en 3' du ddNTP : ainsi l'élongation s'arrête. Tu as obtenu un marquage aux extrémités. 

 

 

Le contenu des tubes est donc une collection de DNA synthétisés de longueur variable (les fragments de DNA différents s'arrêtent base après base donc possibilité de lire la séquence). Tu déverses tout cela sur un gel une polyacrylamide pour réaliser une éléctrophorèse. La suite est classique : les bases migrent du pole - vers le pole + et cela selon leur poids (les plus légères migrants le plus loin). 

 

    

 

 

Ainsi en analysant le Sanger tu peux étudier la séquence de ton DNA ! (Magie) 

 

C'est pour cela que l'item 29E est vrai ! Pour répondre à ta seconde question, la nature des sondes et des amorces peut être du DNA ou du RNA tout dépend de ce que tu veux faire : c'est variable selon les exercices ! 

 

Plein de courage 

[Chat_du_Cheshire]

il y a 1 minute, Emmacarena a dit :

Bonsoir @loli  

 

La méthode Sanger, est une méthode très utilisée pour étudier le DNA mais en PACES on passe assez peu de temps pour expliquer le processus. Voici donc LA recette de préparation pour un bon Sanger (et quels sont les ingrédients nécessaires) ! 

 

• Pourquoi faire un Sanger ?

Pour étudier le DNA, et sa composition. Autrement dit, cette méthode permet le séquençage du DNA. 

• Comment faire un Sanger ? 

Au tout début tu possèdes du DNA double brin, que tu soumets à haute température afin de le dénaturer et ainsi d'obtenir deux simples brins de DNA.  Ensuite, tu t'équipes de 4 récipients : disons des tubes à essais ! Dans ces derniers tu y mélanges : le DNA simple brin, un primer (amorce), une DNA polymérase de type I (ou fragment de Klenow cela dépend) et des dNTP ainsi qu'UN SEUL ddNTP marqué.  

 

 

Puisque tu as 4 tubes à essais tu y insères dans chacun un ddNTP correspondant à une base : donc un ddATP, ddCTP, ddTTP, ddGTP. 

 

 

L'intérêt réside dans le fait que la DNA polymérase va synthétiser le brin complémentaire jusqu'à tomber sur le ddNTP à incorporer. Dés qu'elle veut l'insérer, cela lui est impossible puisqu'il manque un groupement hydroxyle en 3' du ddNTP : ainsi l'élongation s'arrête. Tu as obtenu un marquage aux extrémités. 

 

 

Le contenu des tubes est donc une collection de DNA synthétisés de longueur variable (les fragments de DNA différents s'arrêtent base après base donc possibilité de lire la séquence). Tu déverses tout cela sur un gel une polyacrylamide pour réaliser une éléctrophorèse. La suite est classique : les bases migrent du pole - vers le pole + et cela selon leur poids (les plus légères migrants le plus loin). 

 

    

 

 

Ainsi en analysant le Sanger tu peux étudier la séquence de ton DNA ! (Magie) 

 

C'est pour cela que l'item 29E est vrai ! Pour répondre à ta seconde question, la nature des sondes et des amorces peut être du DNA ou du RNA tout dépend de ce que tu veux faire : c'est variable selon les exercices ! 

 

Plein de courage 

[Liliputienne]

@Chat_du_Cheshire  

Révélation

Malheureusement je ne ferai jamais un aussi bon boulot que l'explication sur les bradykinines (j'ai encore l'émotion des couleurs dans ce post)  

 

[loli]

salut @Emmacarena, j'ai voulu avoir une petite explication puis je me retrouve avec un magnifique résumé de oufff !!! merciii beaucoup d'avoir pris le temps pour me détailler tt cela. justement en lisant attentivement ce que tu as écrit, je comprends pas pourquoi dans l'item les désoxynucléotides qui sont marqués; c'est pas plutôt les didésoxynucléotides qui doivent être marqués. belle soirée         

Edited November 13, 2020 by loli

[Liliputienne]

@loli En fait avec Sanger tu peux effectuer différents marquages ! Soit un marquage des dNTP avec la radioactivité, soit un marquage de l'amorce par une molécule fluorescente ou sur un ddNTP par une molécule fluorescente. 

Si tu marques le ddNTP tu obtiens un marquage aux extrémités uniquement. 

Si tu marques le dNTP tu obtiens un marquage à chaque dNTP incorporé (Attention cependant il est impératif d'uniquement parler de radioactivité pour la marquage des dNTP ; la molécule fluorescente pourrait elle bloquer l'élongation à leur niveau, ce qui n'est pas le but). 

 

C'est plus clair ?  

[loli]

J'ai loupé totalement cette nuance entre les 2 marquages, c'est pour ça j'ai fait une conclusion archi fausse pour l'utilisation des dNTP.

Merciii tu gère parfaitement  @Emmacarena

[Liliputienne]

Trop top si c'est plus clair ! Max de force à toi