signal BRET

[lounalse]

saluut

est ce que quelqu’un pourrait m’expliquer en gros qu’est-ce que le signal BRET a quoi il sert tout ça j’ai l’impression d’avoir louper un gros truc quand je fais des annales je vois qu’il reviens énormément j’ai un peu de mal à le comprendre tout ça

mercii

[unenoiraude]

saluut @lounalse

tu fais bien de poser la question, c'est quelque chose qui peut en effet tomber au concours.

Alors en fait le signal BRET, on l'utilise pour observer l'activation des effecteurs primaires (en fait la protéine G) donc ça concerne les RCPG.

Le principe du BRET c'est qu'il y a un transfert d'énergie bioluminescente entre la luciférase et la GFP dont l'intensité dépendra de la distance entre ces deux particules. pour être plus précis, la luciférase est ce qu'on appelle le donneur d'énergie: elle émet de la lumière dans une longueur d'onde spécifique (480nm, dans le bleu) qui va être transmise à la GFP si la distance est inférieure à 100 Angstrom. Si cette distance est respecté la GFP émet de la lumière à une longueur d'onde spécifique de 509 nm, dans le vert.

 

Et donc pour étudier le fonctionnement du RCPG, on dispose la luciférase sur la sous unité alpha de la protéine G et la GFP sur la sous unité Beta-gamma. Après tu connais le fonctionnement du RCPG: quand un ligand vient se fixer on va observer une liaison de la protéine G au RCPG puis une dissociation de la protéine G avec d'un coté Galpha (luciférase) et de l'autre Gbeta-gamma (GFP) --> donc tu observes une augmentation de la distance entre la luciférase et la GFP ce qui veut dire que ton signal BRET va diminuer voir disparaitre si la distance dépasse 100 A. 

 

Un point particulier: le cas des agonistes inverses

il faut se rappeler de la théorie moderne sur les RCPG, qui envisage que à l'état basal (absence de ligand), ils ont une activité constitutionnelle. autrement dit la protéine G est déjà activée et dissociée donc dans ce cas, sans ligand, le signal BRET est diminué voir inexistant. Et lorsque l'agoniste inverse vient se fixer, il va entrainer une réassociation des sous unités alpha et beta-gamma donc une augmentation du signal BRET

 

si tu n'as pas compris, n'hésites pas à me le dire 

[lounalse]

@unenoiraude du coup ça sera toujours le cas la lumina luciferase sera toujours sur la protéine alpha et le GFP sur bêta gamma et donc le signal BRET diminue toujours sauf pour les agonistes inverses où il augmente ? et d’ailleurs je vois pas la différence entre un agonistes inverses et un antagoniste inverses

ah oui et j’en profite juste deux petites questions 

Est ce que du coup si on fait avec un système BRET, lorsque on applique des concentrations croissantes de morphine, la diminution du signal BRET c’est parce que les sous unités s’éloigne petit à petit du coup, mais après est ce que les complexes protéines se rejoignent et on peut voir une augmentation du signal ? je sais pas si c’est possible ou si c’est une question bête

et dernière chose dans une annale de Rangueil 2018 on nous dit « lorsque la liaison non spécifique est mesurée en présence d’un excès de naloxone froide, la liaison spécifique à l’équilibre de [H3]-X sur une préparation de mb cellulaire est saturable avec un Kd de 1nM » et l’item « la cible X est une récepteur opioïde » est compté vrai mais comment on le démontre ?

[unenoiraude]

Alors dans les diapos du prof, il donne l'exemple avec la luciférase sur alpha et la GFP sur Beta gamma donc si dans le qcm rien n'est précisé c'est ce cas de figure qu'il faut envisager. mais après il est aussi possible de mettre la luciférase sur alpha et la GFP sur le RCPG par exemple pour observer l'interaction entre le récepteur et ses effecteurs primaires mais ça reste le même principe de fonctionnement.

 

Alors on parle d'agoniste inverse et d'antagoniste neutre. l'antagoniste inverse ça n'existe pas:

- l'agoniste inverse, comme je t'ai dit, il faut envisager son action sur un récepteur actif de façon constitutive (pré couplage RCPG-protéine G), donc activé sans la présence du ligand. quand l'agoniste inverse vient se lier sur le récepteur il entraine les effet inverses de l'agoniste en induisant le découplage du récepteur et de la protéine ce qui supprime l'effet observé de l'activité constitutive (on dit que l'agoniste inverse a une activité intrinsèque de -1)

- un antagoniste neutre à l'inverse n'a absolument aucun effet si il est observé tout seul, si on veut mesurer ses effets il faut d'abord stimuler les récepteurs par un agoniste: ensuite l'antagoniste va reverser les effets de l'agoniste ce qui amène à une activité intrinsèque de 0 

dans ces antagonistes neutres tu as les antagonistes dits compétitifs et les non compétitifs (si t'es pas au point là dessus je peux t'expliquer aussi)

 

Alors pour la morphine et le signal BRET: du moment où la morphine agit sur le récepteur en tant qu'agoniste le signal BRET va diminuer du fait de l'éloignement des sous unités comme tu l'as dit. Après, si le signal réaugmente, cela signifie que les effets de la morphine se sont arrêtés ce qui entraine le recouplage des sous unités et donc l'augmentation du signal. 

 

pour ta dernière question, dans une expérience de saturation à l'équilibre on choisit un ligand froid en excès (ici la naloxone) qui va nous permettre de déterminer indirectement la liaison non spécifique puisqu'il va se lier sur le récepteur d'intérêt, il faut donc que ce récepteur soit sa cible. La naloxone cible les récepteurs de la Morphine, ou récepteurs opioïdes donc le récepteur d'intérêt dans l'expérience est forcément un récepteur opioïde.

 

[lounalse]

@unenoiraude ok merci beaucoup !! 

Il y a 9 heures, unenoiraude a dit :

dans ces antagonistes neutres tu as les antagonistes dits compétitifs et les non compétitifs (si t'es pas au point là dessus je peux t'expliquer aussi)

il me semble que c’est antagoniste neutre compétitif = surmontable donc une pente = 1 sur le diagramme de Schild et un antagoniste neutre non compétitif = insurmontable donc une pente différente de 1 c’est ça ?

[unenoiraude]

Yes tout à fait ça

[Djordy]

Bonsoir,

Je viens de lire les explications et merci, j'ai bien compris. Mais juste que je ne sais pas comment déterminer la pente et savoir si elle est 1 ou différent de 1. 

 

Merci

[Djordy]

C'est encore moi ,

-je ne comprends pas aussi les expériences de saturation à l'équilibre et de compétition à l'équilibre si quelqu'un pourrait m'aider

- et aussi la manière de déterminer la pA2. 

Bonne soirée .

[lounalse]

il y a 13 minutes, Djordy a dit :

Bonsoir,

Je viens de lire les explications et merci, j'ai bien compris. Mais juste que je ne sais pas comment déterminer la pente et savoir si elle est 1 ou différent de 1. 

 

Merci

il faut que tu fasse (delta y)/ delta x en utilisant deux points de ta droite  IMG_1252.pdf

dis moi si tu arrives à voir la photo je sais pas si elle s’est envoyé

il y a 4 minutes, Djordy a dit :

et aussi la manière de déterminer la pA2. 

pour la pA2 elle se lit sur l’axe des abscisses en prenant pour ordonnée (log DR - 1) = 0

[Djordy]

Non, je ne vois pas la photo

[lounalse]

il y a 3 minutes, Djordy a dit :

Non, je ne vois pas la photo

https://ibb.co/rG3wRKj

[Djordy]

Donc si j'ai bien compris, pour la pA2 dans le CCB, si je lis sur l'axe des abscisse en partant de l'ordonnée qui est égal à 0 je devrais trouver 10

[lounalse]

à l’instant, lounalse a dit :

https://ibb.co/rG3wRKj

je sais pas si c’est bien nette mais du coup t’a bien delta y qui est 3 et delta x aussi de 3 donc ta pente vaut 1 

il y a 1 minute, Djordy a dit :

Donc si j'ai bien compris, pour la pA2 dans le CCB, si je lis sur l'axe des abscisse en partant de l'ordonnée qui est égal à 0 je devrais trouver 10

oui oui !

[Djordy]

D'accord, je vois.  Et les valeurs de Delta et de x comment je les trouve. Si j'ai bien compris, le 3 et le 3 c'était pour que je comprenne le calcul de la pente. Je prends ceux qui sont en abscisse ou en ordonné ?! Désolé mais je suis un peu largué et merci de tes réponses. Elles sont claires mais j'arrive pas trop à comprendre.

[lounalse]

il y a 4 minutes, Djordy a dit :

D'accord, je vois.  Et les valeurs de Delta et de x comment je les trouve. Si j'ai bien compris, le 3 et le 3 c'était pour que je comprenne le calcul de la pente. Je prends ceux qui sont en abscisse ou en ordonné ?! Désolé mais je suis un peu largué et merci de tes réponses. Elles sont claires mais j'arrive pas trop à comprendre.

non enfaite si tu veux pour déterminer ton delta x et delta y tu regarde en gros “de combien de carreaux tu te décales” pour delta x

et de “combien de carreaux tu montes” pour delta y 

j’ai pris un exemple avec les meme valeurs ça aurait était plus visible avec des différentes mais bref si tu regardes le schéma tu vois que je me décale de trois carreaux à droite pour x et je monte de trois carreaux pour y 

est ce que tu vois ? pareil pour le ccb du coup tu trouvais 0,5 je crois 

et tu peux prendre n’importe quel points sur ta droite t’a juste à en prendre deux

Edited November 24, 2020 by lounalse

[Djordy]

Oui, j'ai vu. Merci beaucoup

Et pour les expériences ?

[solene11]

Saluut,

 

Pour la pA2, @lounalse a tout a fait raison, elle se lit sur l’axe des abscisses en prenant pour ordonnée (log DR - 1) = 0.

 

Je t'invite à aller voir ce sujet qui t'aidera surement pour la pA2 :

Pour le calcul de la pente, il faut en effet prendre 2 points de ta droite. Pour le delta x, tu comptes le nombre de carreaux horizontalement entre tes 2 points ("de combien de carreaux tu te décales") et pour le delta y, tu comptes le nombre de carreaux verticalement entre les 2 points ("de combien de carreaux tu montes"). Ensuite tu fais le rapport de delta y sur delta x et tu as ta pente.

 

Voilaa

[Djordy]

Merciiiii j'ai bien compris comment on détermine la pA2.