CHACOTTE Posted January 4, 2015 Posted January 4, 2015 Bonsoir ! Je n'ai pas vraiment compris le fonctionnement de la méthode de Sanger, en ce qui concerne le séquençage de l'ADN... Si vous pouviez m'expliquer, ce serait sympa Merci !
ninou Posted January 5, 2015 Posted January 5, 2015 Salut ! Alors SANGER: c'est un méthode qui permet de séquencer l'ADN. Pour cela il te faut : la pol I, des dNTP, des amorces et des ddNTP marqués par fluorescence. On note que chaque type de ddNTP est marqué par un fluorochrome différent. On place de adn à sequencer et tout ce petit bazar ensemble. Ce qui va se passer c'est que la pol l va synthétiser des ADNc de ceux qu'on veut séquencer en utilisant une amorce + des dNTPs OU des ddNTPs Il est important de savoir que: l'incorporation de ddntps dans un ADNc arrête l'élongation de celui ci par absence de OH en 3' que cette incorporation de ddntp n'est pas systèmatique, pour chaque base de l'adn a sequencer il peut y avoi incorporation par la pol I: soit son dntp complémataire, soit son ddntp complémentaire. Si c'est le dntp qui est incorporé, l'élongation continue. C'est ces propriétés des ddntp qui vont être responsable de ce qu'on obtient dans les diapos 128 et 129. On obtient plein de fragments arrêtés à des stades d'élongations différents. Ensuite on passe ces fragment dans une machine qui les classera par taille et qui va par la suite analyser la fluorescence de chacun d'eux. On rappelle que seuls les ddntps sont fluorescents ( donc seule la dernière base de chaque fragment sera fluorescente ) et que chacun des type de ddntps (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) possède un fluorochrome différent. La machine analysera donc les fragments du plus petits au plus grands ce qui permettra un séquençage cohérent, et associera le type de fluorescence qu'elle analyse à la base correspondante. Pour schématiser, on peut dire, à partir de l'exemple du poly: la machine voit d'abord (la partie souligné désigne l'amorcequ'on connaît ) AGGTC (5pb), en analysant la fluorescence, elle déduit que la 5e base est un C puis AGGTCG (6pb), en analysant la fluorescence , elle déduit que la 6e base est un G puis AGGTCGC (7pb), en analysant la fluorescence, elle déduit que la 7e base est un C et ainsi de suite jusqu'à la fin du fragment à séquencer. Voila, j'espere que j'ai été claire, surtout que c'est pas évident à expliquer comme truc, j'espère sincèrement que tu as compris ! Bon courage !
CHACOTTE Posted January 6, 2015 Author Posted January 6, 2015 Parfait !!! Vraiment merci pour cette réponse, qui n'est pas facile à expliquer ! C'est très clair
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