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'[TATOUCAPTE Chimie Organique 3]'

TD1 vecteurs

carolineb

By carolineb
in UE8 TC Recherche

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Posted by Metallica,

Cc     Pour la A,deux hypothèses soit on considère que le vecteur en se répliquant en même temps que le génome hôte, va amplifier la quantité d'adnc soit on considère la présence de deux polymérases qui vont produire plein d’ARNm qui serviront de socle pour une RT-PCR qui augmentera énormément la qtté d'adnc (celle-ci marche beaucoup mieux).        
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carolineb TAT Vador

carolineb

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Bonsoiiir

 

en refaisant le td je me suis rendu compte que certains items étaient pas (du tout) clairs pour moi : 

 

 

QCM 5 : Une fois le cDNA inséré dans le plasmide, ce vecteur permettra de :

A/ produire des grandes quantités de cDNA
B/ conférer la résistance à l’ampicilline aux cellules hôtes
C/ préparer une ribosonde en utilisant la RNase de T7
D/ produire une sonde ARN en utilisant la RNA polymérase de SP6
E/ séquencer l’insert en utilisant une amorce qui s’hybride avec le promoteur de la RNA polymérase SP6.

 

réponses : ABDE 

pour l'item A je vois pas trop comment ça pourrait produire de gdes qttés? et dans quels cas on fait ça?

pour CDE je comprends pas trop, en fait qu'est ce qu'il a à savoir sur SP6 et T7?

 

Révélation

1591652402-capture-d-ecran-2020-06-08-a-

 

réponses : AC 

item C : je vois pas comment le cDNA pourrait être excisé par Taq1 sachant qu'il ne possède pas de site pour Taq1 

et pour l'item D : la correction dit "il faut l'intégralité de la séquence" mais je comprends pas non plus si on utilise ClaI et AccI on a bien l'intégralité de la séquence non? 

 

 

 

QCM 12 : Après transfection (c’est-à-dire après introduction) du plasmide recombinant dans des cellules de mammifères, vous étudiez la protéine exprimée.

A/ Après transfection du plasmide contenant le cDNA issu du sujet normal, l’absence d’expression de la protéine peut être due à une erreur dans le clonage --> VRAI

pq une erreur de clonage? 

 

QCM 20 Ayant mis au point votre méthode de Southern, vous analysez maintenant les ADN des différentes souris générées.   

A/  Aucun signal ne sera observé s’il s’agit d’une souris homozygote pour le knockout de GBA --> faux

comment on pourrait observer un signal si la souris est homozygote pour le KO?

 

Révélation

1591653045-capture-d-ecran-2020-06-08-a-

pour l'item E (faux), en fait c'est la correction que je ne comprends pas : "le vecteur recombinant est doté de sites de restriction Mbol en périphérie de l'ADNc inséré, ce qui entraîne, en utilisant BcII et Mbol, l'obtention de 3 fragments de taille identique quel que soit le sens d'insertion" j'arrive pas à voir le lien entre les 2 ni pourquoi on obtiendrait 3 fragments identiques

 

 

et pour finir j'ai vu 1 ou 2 qcm qui traitait de la stringence etc mais ça on l'a vu au S1, donc ça ne peut pas tomber au cc du S2 si? 

 

Un grand grand merci d'avance! 

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Metallica TAT Vador

Metallica

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Cc

 

Il y a 5 heures, carolineb a dit :

pour l'item A je vois pas trop comment ça pourrait produire de gdes qttés? et dans quels cas on fait ça?

 

Pour la A,deux hypothèses soit on considère que le vecteur en se répliquant en même temps que le génome hôte, va amplifier la quantité d'adnc soit on considère la présence de deux polymérases qui vont produire plein d’ARNm qui serviront de socle pour une RT-PCR qui augmentera énormément la qtté d'adnc (celle-ci marche beaucoup mieux).

 

 

 

 

Edited by Metallica
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Metallica TAT Vador

Metallica

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Il y a 5 heures, carolineb a dit :

our CDE je comprends pas trop, en fait qu'est ce qu'il a à savoir sur SP6 et T7?

 

 pour la D, sp6 donne une ARN polymérase donc ouais on pourra se servir de celle-ci pour constituer une sonde d'ARN ^^

Pour la C c'est faux parce que si on utilise une RNase par définition on détruit des séquences d'ARN (donc pas de création de sonde)

Et la E , sachant que l'insert sera à proximité du gène SP6, si on utilise une amorce reconnaissant SP6(ou son promoteur) , on peut effectivement séquencer l'insert (Méthode Sanger ou autre)

 

Il y a 5 heures, carolineb a dit :

QCM 12 : Après transfection (c’est-à-dire après introduction) du plasmide recombinant dans des cellules de mammifères, vous étudiez la protéine exprimée.

A/ Après transfection du plasmide contenant le cDNA issu du sujet normal, l’absence d’expression de la protéine peut être due à une erreur dans le clonage --> VRAI

pq une erreur de clonage? 

 

 

Étrange , le clonage à l'air de s’être à priori bien passé vu qu'on nous dit que le plasmide contient le cdna du coup là à première vue chépas pourquoi ils le comptent vrai (peut-etre qu'il considère qu'un clonage consiste à insérer un adnc dans vecteur qui permettra son expression auquel cas ça sera juste)

 

Il y a 5 heures, carolineb a dit :

QCM 20 Ayant mis au point votre méthode de Southern, vous analysez maintenant les ADN des différentes souris générées.   

A/  Aucun signal ne sera observé s’il s’agit d’une souris homozygote pour le knockout de GBA --> faux

comment on pourrait observer un signal si la souris est homozygote pour le KO?

 

 

Le Ko du gène ne le fait pas disparaitre et n’empêche pas la sonde de s'hybrider avec lui donc on aura quand même un signal en Southern

 

Il y a 5 heures, carolineb a dit :

pour l'item E (faux), en fait c'est la correction que je ne comprends pas : "le vecteur recombinant est doté de sites de restriction Mbol en périphérie de l'ADNc inséré, ce qui entraîne, en utilisant BcII et Mbol, l'obtention de 3 fragments de taille identique quel que soit le sens d'insertion" j'arrive pas à voir le lien entre les 2 ni pourquoi on obtiendrait 3 fragments identiques

 

Les ER permettant l'insertion de l'insert dans le plasmide portent toutes la séquence 5'GATC3' du coup quand les sites vont se réassembler aux deux extrémités de l'insert on aura la réapparition d'un site GATC site qui est reconnu par MboI. De plus, le site BcII se situant dans la séquence codante, il sera reconnu après recombinaison. Donc au final, quel que soit le mode d'insertion, on aura deux sites aux extrémités du cdna reconnus par MboI  et un site dans la séquence de l'Adn reconnu par BcII ce qui nous donnera bien à l'arrivée , trois fragments qui ne donneront aucune information sur le mode d'insertion du cdna.

 

 

Il y a 5 heures, carolineb a dit :

et pour finir j'ai vu 1 ou 2 qcm qui traitait de la stringence etc mais ça on l'a vu au S1, donc ça ne peut pas tomber au cc du S2 si? 

 

Non ça tombera pas au S2 (si c'est le cas par le plus grand des hasards y aura des rappels)

 

Il y a 5 heures, carolineb a dit :

éponses : AC 

item C : je vois pas comment le cDNA pourrait être excisé par Taq1 sachant qu'il ne possède pas de site pour Taq1 

et pour l'item D : la correction dit "il faut l'intégralité de la séquence" mais je comprends pas non plus si on utilise ClaI et AccI on a bien l'intégralité de la séquence non? 

 

https://zupimages.net/viewer.php?id=20/24/6bpn.jpg

 

 

 

 

 

carolineb TAT Vador

carolineb

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Le 09/06/2020 à 06:09, Metallica a dit :

Étrange , le clonage à l'air de s’être à priori bien passé vu qu'on nous dit que le plasmide contient le cdna du coup là à première vue chépas pourquoi ils le comptent vrai (peut-etre qu'il considère qu'un clonage consiste à insérer un adnc dans vecteur qui permettra son expression auquel cas ça sera juste)

 

 

ici clonage = transfection?

 

Le 09/06/2020 à 06:09, Metallica a dit :

Les ER permettant l'insertion de l'insert dans le plasmide portent toutes la séquence 5'GATC3' du coup quand les sites vont se réassembler aux deux extrémités de l'insert on aura la réapparition d'un site GATC site qui est reconnu par MboI. De plus, le site BcII se situant dans la séquence codante, il sera reconnu après recombinaison. Donc au final, quel que soit le mode d'insertion, on aura deux sites aux extrémités du cdna reconnus par MboI  et un site dans la séquence de l'Adn reconnu par BcII ce qui nous donnera bien à l'arrivée , trois fragments qui ne donneront aucune information sur le mode d'insertion du cdna.

 

comment on peut savoir que ce sera 3 fragments égaux? 

 

merci bcp d'avoir pris le temps! @Metallica

 

 

Metallica TAT Vador

Metallica

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Il y a 7 heures, carolineb a dit :

ici clonage = transfection?

 

Clonage = insertion d'un cdna dans un vecteur

 

Il y a 7 heures, carolineb a dit :

comment on peut savoir que ce sera 3 fragments égaux? 

 

C'est pas "identiques" dans le sens ou les 3 fragments font la même taille mais plutôt dans le sens ou y aura pas de différences de taille entre les 3 fragments obtenus pour une insertion et les 3 obtenus pour l'insertion inverse ^^

carolineb TAT Vador

carolineb

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Il y a 5 heures, Metallica a dit :

Clonage = insertion d'un cdna dans un vecteur

 

ah d'accord, oui c'est bizarre pcq dans l'énoncé ils disent "plasmide recombinant"

 

Il y a 5 heures, Metallica a dit :

C'est pas "identiques" dans le sens ou les 3 fragments font la même taille mais plutôt dans le sens ou y aura pas de différences de taille entre les 3 fragments obtenus pour une insertion et les 3 obtenus pour l'insertion inverse ^^

je crois que j'ai compris, merciii!

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