Questions vecteurs

[EmmaTOM]

Saluuuut, j'aurais plusieurs questions ahah. Merci d'avance pour votre aide  

 

https://zupimages.net/viewer.php?id=20/23/dtqt.png

Je ne comprend pas la C 

 

https://zupimages.net/viewer.php?id=20/23/hmrh.png

je ne comprend pas la C non plus ahah

 

"Dans l’étalonnage de la gel filtration, la protéine de 30 kDa sort dans un volume d’élution plus faible que la protéine de 120 kDa " faux car + important, mais la petite protéine va être la dernière à sortir, du coup je comprend pas trop l'histoire du volume d'élution + important

 

https://zupimages.net/viewer.php?id=20/23/twth.png

A, C comment on sait tout ça? PAR COEUR ? Si possible, je pourrais avoir un mini récap euca/proca pour ça? Histoire que je ne confonde plus  

Je ne comprend pas la E

 

Les cellules homologues recombinées correctement sont Néo sensible et résistante au G418 ? 

 

Le  gène  Néo  permettra  de  sélectionner  les  cellules  dans  lesquelles  une  recombinaison  homologue  a  été  effectuée, compté faux 

Mais je ne comprend pas vraiment pourquoi, la correction dit "gène Néo permet de sélectionner les cellules ou il y a eu recombinaison homologue. Le gène suicide permet de conserver seulement les cellules où la recombinaison est homologue" 

Ça veut dire, que lorsqu'on fait les cassettes Néo et TK, les cellules n'ont pas forcément fait une recombinaison homologue ? 

 

https://zupimages.net/viewer.php?id=20/23/yo05.png

Pourquoi D fausse? A quel moment on a parlé de doser des Ag alors qu'on fait un ELISpot?

Et du coup la E je comprend pas non plus, parce que je pensais que l'on dosait des Ac 

 

 

[Fantôme]

Salut, 

- Pour la C, si tu crée ton plasmide recombinant tu dois forcément utiliser Hind III et XbaI ( ou du moins des enzymes qui coupent ces sites) et dans l'énoncé on te donne l'ordre, KpnI est après HindIII, donc il est dans la partie du vecteur que tu élimines pour y mettre ton insert, donc le site disparaît, impossible de couper.

 

- Pour l'autre C , pour moi il y à deux problèmes, déjà tu coupes avant le codon stop, et ça sert à rien comme dis l'énoncé parceque dans ton vecteur tu as deux extrémités BamI, donc même si tu en fais une différente, elle se mettra sur le côté du vecteur qu'elle voudra, donc tu ne peux pas prévoir l'orientation non plus avec ca .En plus je vois pas comment tu la ré-insère dans le vecteur si il n'a que des extrêmités BamI ... Mais il n'y à pas non plus le détail de ce que ça coupe apparemment, donc bizarre.

 

- Pour la gel filtration, le principe c'est que les petites molécules s'insinuent entre les mailles alors que les grosses passent desuite, donc les plus petites sont plus lentes et "tombent" après les grosses, et pour qu’elles tombent justement, il leur faut un certain volume d'élution, tu en mets petit à petit, comme les grosses arrivent d'abord il leur en faut moins, puis tu continue à ajouter du volume et les petites arrivent, donc elles auront un plus gros volume d'élution.

 

- Pour la A, la correction est assez détaillée, c'est pas du par cœur, au centre du vecteur tu as son nombre de pb, et tu as la position en base des enzymes, donc tu sais où ça coupe, où ton insert va se mettre, puisque il va entre les deux lieux de coupure tu peux calculer sa taille en pb en faisant l'un moins l'autre, je sais pas si tu vois mieux ?

Pour la C, dans mon cours j’ai noté que "les cellules hôtes naturelles des plasmides sont les bactéries", du coup j'aurais mis faux, mais le TeR je sais pas comment on devine, peut être juste parceque il est dans un plasmide justement ?Pour ça il faut voir avec quelqu'un d'autre je pense ...Et le récap je comprends pas trop un récap de quoi du coup, désolée, quelqu’un d'autre pourra probablement t'aider plus que moi 

La E : pénicilline sert à la résistance antibiotique, du coup elle reste forcément,en tout cas c'est ce qu'on veut, mais toujours pareil, je m'y connais pas en tétracyclines, faudra que je regarde mon cours  

 

- Là non, une recombinaison réussie c'est avec :

   -selection positive donc résistance à : G418, neomycine, généticyne

   -selection négative donc sensible à : gancyclovir (cassette thymidine kinase)

 

- C'est vrai que c'est bizarre, j'aurais hésité, je sais pas si c'est compté vrai le Néo tout seul sans la thymidyne kinase, et je comprends pas trop la correction , du coup je vais attendre aussi l'explication de quelqu'un d'autre  

 

- Là je sais pas trop ce qu'il faut en penser, je sais que dans la description de l'élispot, on explique que c'est pour la détection et numération des cellules sécrétrices d'Ac, mais il y a aussi un exemple avec des cytokines donc des Ag, mais en général les QCM classent l'élispot dans la détection des cellules sécrétrice d'Ac seulement ... Je pense que c'est dans l'énoncé donc pas à remettre en question, et on te détaille bien qu'on te fourni les Ac, mais en QCM je sais pas comment il aurait fallu répondre, c'est vraiment vicieux, c(est une annale ou du tutorat ?

Pour le QCM en général, sans parler de l'élispot, on te parle d'interleukines, donc c'est un Ag, et dans l'énoncé on te dis qu'on te fournis des Ac, si c'est pour les doser, ça va être compliqué ...

 

 

Voilà, du coup j'attend aussi pour les questions restantes  

Edited June 1, 2020 by R2019

[MarleneHirtzig]

Bonjour, 

- Concernant les 3 premières questions, je n'ai rien à ajouter, R2019 a raison.

 

-  Les plasmides sont des vecteurs qui sont utilisés chez la bactérie, c'est une de ses caractéristiques et il faut avoir le réflexe de se dire plasmide = dans une bactérie. Concernant le promoteur TeR, il n'y a pas de liste à savoir. Le promoteur présent dans le vecteur dépend de la cellule hôte dans laquelle ce dernier va être inséré. Par exemple si un vecteur est préparé pour être intégré dans une cellule eucaryote, il portera un promoteur eucaryote.

Le rôle d'un promoteur dans la construction d'un vecteur est de pouvoir faire exprimer ce vecteur dans la cellule hôte, c'est à dire induire la réplication et/ou la transcription du gène recombinant qu'il contient.

Après il aurait peut être été bien qu'ils précisent la nature du promoteur.

Pour l'item E, la question portait plus sur la conséquence de l'insertion de l'ADNc dans le vecteur. En effet, le site de restriction bam H1 se situe au milieu du gène de résistance TetR. L'ouverture du vecteur à ce niveau là coupe le gène TetR en 2 ce qui le rend inactif. Ainsi, le vecteur n'apporte plus la résistance à la tétracycline donc les bactéries transformées par ce vecteurs  vont mourir si elles sont mise en culture dans un milieu enrichit en tétracycline. de même, le gène de résistance à l'ampicilline reste intact car il n'est pas porteur du site de restriction, il sera donc fonctionnel et permettra au bactéries transformées par ce vecteur de se développer dans un milieu de culture enrichit en ampicilline.

 

- Pour s'assurer que la recombinaison est homologue, il faut qu'il y ait une DOUBLE sélection avec les cassettes. La présence d'une seule de ces cassettes n'est l'assurance totale que cette recombinaison est bien homologue. C'est en cela que l'item est faux car on ne parle ici que de la cassette Néo qui permet une sélection positive alors qu'il faut aussi avoir la cassette TK pour la sélection négative. La correction donnée n'est pas forcément bien formulée, mais elle sous-entend ça.

 

- Pour ce type de QCM où on vous pose des question sur des techniques, il faut traiter chaque item indépendamment, même si la figure qui vous a été donnée dans l'énoncée correspond à une certaine technique, le but étant de tester vos connaissances sur l'utilisation de ces techniques. Ici, le but de la manipulation était de déterminer l'activité sécrétrice des cellules dendritiques; ELIspot permet de déterminer le nombre de cellules dendritiques qui produisent de IL-12, mais pour doser IL-12 quantitativement produite dans le milieu, on utilise d'autres techniques de détection d'antigène ce coup-ci vu que l'IL-12 est relarguée dans le milieu. Le fait de fournir des Ac correspond à détailler les outils dont tu disposes pour réaliser les différentes manipulations. On cherche donc bien à dose IL-12 qui est un Ag, c'est pour cela que l'ELISA indirect n'est pas une bonne solution.

 

J'espère que cela a pu vous éclairer, n'hésitez pas à reposer des questions s'il y a quelque chose de pas clair. Ce qui est important dans ce type de QCM est de bien se baser sur ce que dit l'énoncé pour répondre, c'est la clé !!!

Bon courage

[EmmaTOM]

  On 6/1/2020 at 10:22 AM, R2019 said:

je sais pas si tu vois mieux ?

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Si ahah, mercii

 

 

  On 6/1/2020 at 10:22 AM, R2019 said:

 

- Là non, une recombinaison réussie c'est avec :

   -selection positive donc résistance à : G418, neomycine, généticyne

   -selection négative donc sensible à : gancyclovir (cassette thymidine kinase)

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Je note!!

 

  On 6/1/2020 at 10:22 AM, R2019 said:

c(est une annale ou du tutorat ?

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C'est de la prépa..

 

  On 6/1/2020 at 1:41 PM, MarleneHirtzig said:

Pour l'item E, la question portait plus sur la conséquence de l'insertion de l'ADNc dans le vecteur. En effet, le site de restriction bam H1 se situe au milieu du gène de résistance TetR. L'ouverture du vecteur à ce niveau là coupe le gène TetR en 2 ce qui le rend inactif. Ainsi, le vecteur n'apporte plus la résistance à la tétracycline donc les bactéries transformées par ce vecteurs  vont mourir si elles sont mise en culture dans un milieu enrichit en tétracycline. de même, le gène de résistance à l'ampicilline reste intact car il n'est pas porteur du site de restriction, il sera donc fonctionnel et permettra au bactéries transformées par ce vecteur de se développer dans un milieu de culture enrichit en ampicilline.

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Ah je comprend mieux vu comme ça

 

  On 6/1/2020 at 1:41 PM, MarleneHirtzig said:

J'espère que cela a pu vous éclairer, n'hésitez pas à reposer des questions s'il y a quelque chose de pas clair. Ce qui est important dans ce type de QCM est de bien se baser sur ce que dit l'énoncé pour répondre, c'est la clé !!!

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Merci beaucoup !!!