OxyGenS Posted May 12, 2020 Posted May 12, 2020 Salut, J'ai pas trop compris pour ces techniques ce qu'il se passe entre le moment où on met les Ac (liés à la bille de sépharose) et le résultat de l'électrophorèse. Vous pouvez me réexpliquez svp ? Merci Quote
OxyGenS Posted May 12, 2020 Author Posted May 12, 2020 (edited) Re @Metallica 1) Je comprends pas bien ce que tu veux dire par là : "Après tu procèdes à une étape de lavage pour dissocier l'Ag du reste du complexe ( celui qui t’intéresse de base )" Précédemment tu as séparé tes complexes du reste de l'extrait (séparation permise par l'ultracentrifugation) et là on sépare l'Ag de l'Ac couplé à la bille de sépharose ? 2) "soit tu utilises une électrophorèse suivie d'une immunodétection" dans ce cas-là où on n'a pas préalablement radiomarqué nos protéines, on ne pourra détecter que des épitopes séquentiels ? 3) Si on a radiomarqué les protéines, on pourra détecter tous les épitopes ? En fait je comprends pas pcq dans tous les cas on fait une électrophorèse donc ça devrait dénaturer l'Ag ? C'est pas clair pour moi et j'ai du mal à poser les bonnes questions du coup dsl 4) Dans la co-immunoprécipitation, en reprenant l'exemple du cours (protéine A est précipitée, elle est associée à protéine B) : comment savoir que c'est la protéine B qui interagit avec A et par conséquent comment savoir quels Ac on met pour l'immunodétection ? On teste plein d'Ac ? Edited May 12, 2020 by OxyGenS Quote
Metallica Posted May 12, 2020 Posted May 12, 2020 il y a 14 minutes, OxyGenS a dit : 1) Je comprends pas bien ce que tu veux dire par là : "Après tu procèdes à une étape de lavage pour dissocier l'Ag du reste du complexe ( celui qui t’intéresse de base )" Précédemment tu as séparé tes complexes du reste de l'extrait (séparation permise par l'ultracentrifugation) et là on sépare l'Ag de l'Ac couplé à la bille de sépharose ? Que ça soit l'Ag ou 'Ag+l'Ac c'est pas si important dans la mesure ou il n'y aura que l'Ag qui provoquera un signal , l'important que d'enlever la bille qui n'a d'utilité que pour l'immunoprécipitation proprement dite. il y a 18 minutes, OxyGenS a dit : "soit tu utilises une électrophorèse suivie d'une immunodétection" dans ce cas-là où on n'a pas préalablement radiomarqué nos protéines, on ne pourra détecter que des épitopes séquentiels ? Ouaip mais à partir du moment ou tu sais de base que l'Ac qui a permis l'immunoprécipitation ne reconnait pas un épitope séquentiel, si tu as signal associé relié à l'Ag , meme si celui si à été produit par la reconnaissance d'un épitope séquentiel , tu pourras en conclure de par la présence de signal, que l'Ac qui a permis l'immunoprecipitation (et non pas celui qui a permis la révélation en immunotransfert) reconnait un épi conformationnel. il y a 22 minutes, OxyGenS a dit : Si on a radiomarqué les protéines, on pourra détecter tous les épitopes ? ben non c'est une alternative à l'immunodetection , tu marques tout dès le début comme ça tu t'évites une immunodétection après électrophorèse il y a 26 minutes, OxyGenS a dit : En fait je comprends pas pcq dans tous les cas on fait une électrophorèse donc ça devrait dénaturer l'Ag ? Du coup c'est à cause de ce que j'ai dit au dessus il y a 27 minutes, OxyGenS a dit : Dans la co-immunoprécipitation, en reprenant l'exemple du cours (protéine A est précipitée, elle est associée à protéine B) : comment savoir que c'est la protéine B qui interagit avec A et par conséquent comment savoir quels Ac on met pour l'immunodétection ? On part du principe que tu connais l'une des deux protéines en question et que tu as des Ac spécifiques de celle-ci. Si la deuxième prot est accrochée à celle reconnue par les Ag , elle sera immunoprécipitée puis révélée après électrophorèse, par des Ac reconnaissant des épitopes séquentiels sur celle-ci Quote
OxyGenS Posted May 12, 2020 Author Posted May 12, 2020 il y a 50 minutes, Metallica a dit : par des Ac reconnaissant des épitopes séquentiels sur celle-ci Pour l'immunodétection, on est censé savoir quels Ac vont reconnaître des épitopes séquentiels de B ou on teste pleins d'Ac jusqu'à trouver ceux qui reconnaissent la protéine B ? il y a 52 minutes, Metallica a dit : Que ça soit l'Ag ou 'Ag+l'Ac c'est pas si important dans la mesure ou il n'y aura que l'Ag qui provoquera un signal Dsl je comprends pas il y a 52 minutes, Metallica a dit : Ouaip mais à partir du moment ou tu sais de base que l'Ac qui a permis l'immunoprécipitation ne reconnait pas un épitope séquentiel, si tu as signal associé relié à l'Ag , meme si celui si à été produit par la reconnaissance d'un épitope séquentiel , tu pourras en conclure de par la présence de signal, que l'Ac qui a permis l'immunoprecipitation (et non pas celui qui a permis la révélation en immunotransfert) reconnait un épi conformationnel. Je comprends pas ça non plus : tu dis que de base on sait que l'Ac pour l'immunoprécipitation ne reconnait que des épitopes conformationnels, et tu dis qu'on peut en conclure que cet Ac reconnait un épitope conformationnel. A quoi ça sert de le conclure puisqu'on le saurait déjà au début il y a 58 minutes, Metallica a dit : il y a une heure, OxyGenS a dit : Si on a radiomarqué les protéines, on pourra détecter tous les épitopes ? ben non c'est une alternative à l'immunodetection , tu marques tout dès le début comme ça tu t'évites une immunodétection après électrophorèse il y a une heure, OxyGenS a dit : En fait je comprends pas pcq dans tous les cas on fait une électrophorèse donc ça devrait dénaturer l'Ag ? Du coup c'est à cause de ce que j'ai dit au dessus Je reviendrais à tête reposée sur ça je capte plus rien, ça me paraîtra peut-être évident quand je le relirais Quote
Metallica Posted May 12, 2020 Posted May 12, 2020 Il y a 4 heures, OxyGenS a dit : Pour l'immunodétection, on est censé savoir quels Ac vont reconnaître des épitopes séquentiels de B ou on teste pleins d'Ac jusqu'à trouver ceux qui reconnaissent la protéine B on est déjà censé le savoir vu que ce n'est pas l'objectif premier de l'expérience Il y a 4 heures, OxyGenS a dit : Je comprends pas ça non plus : tu dis que de base on sait que l'Ac pour l'immunoprécipitation ne reconnait que des épitopes conformationnels, J'ai dit ça ou ? Quote
luv94 Posted May 13, 2020 Posted May 13, 2020 Il y a 15 heures, OxyGenS a dit : Pour l'immunodétection, on est censé savoir quels Ac vont reconnaître des épitopes séquentiels de B ou on teste pleins d'Ac jusqu'à trouver ceux qui reconnaissent la protéine B ? Dsl je comprends pas Je comprends pas ça non plus : tu dis que de base on sait que l'Ac pour l'immunoprécipitation ne reconnait que des épitopes conformationnels, et tu dis qu'on peut en conclure que cet Ac reconnait un épitope conformationnel. A quoi ça sert de le conclure puisqu'on le saurait déjà au début Je reviendrais à tête reposée sur ça je capte plus rien, ça me paraîtra peut-être évident quand je le relirais @OxyGenS - au départ au moment où tu fais ton immunoprécipitation avec un extrait protéique radio-marqué tu te trouves dans des conditions non dénaturantes, donc là tu peux détecter tous les épitopes de la protéine A. - Cependant ensuite pour la révéler, tu vas faire une électrophorèse en gel de polyacrtamide-SDS qui va dénaturer tes protéines. - mais comme ici tu as intégré au départ des acides aminés radio-marqué dans tes protéines, tu n'as pas besoin d'avoir tous les épitopes pour les révéler puisque tu ne vas pas utiliser des anticorps pour ça mais une autoradiographie qui va te permettre de révéler les protéines grâce aux acides aminés radio-marqué. Donc tous les épitopes ne sont pas disponibles mais on s'en fiche car on n'en a pas besoin ! - si tu fais la même chose mais sans radiomarquer, tu vas précipiter de la même manière dans des conditions non dénaturantes pour être sûr de bien précipiter la protéine d'intérêt (et la protéine B avec) - ensuite pareil, conditions dénaturantes et là au lieu de faire l'autoradiographie pour révéler tu fais un immunotransfert. Donc là tes épitopes conformationnels ont disparu et cette fois tu en aurais besoin pour être le plus sensible possible puisque en immunotransfert tu utilises des anticorps pour révéler tes protéines. Donc effectivement ici sans radiomarquage la technique est moins sensible du fait qu'elle est impactée par la dénaturation des anticorps conformationnels. Est ce que ça te semble plus clair? Quote
OxyGenS Posted May 13, 2020 Author Posted May 13, 2020 (edited) Il y a 11 heures, Metallica a dit : J'ai dit ça ou ? Il y a 16 heures, Metallica a dit : à partir du moment ou tu sais de base que l'Ac qui a permis l'immunoprécipitation ne reconnait pas un épitope séquentiel Il y a 16 heures, Metallica a dit : Que ça soit l'Ag ou 'Ag+l'Ac c'est pas si important dans la mesure ou il n'y aura que l'Ag qui provoquera un signal Tu pourrais m'expliquer ça stp j'ai pas trop compris J'ai compris pour les épitopes reconnus entre l'immunoprécipitation et le SDS qui suit Edit : oui c'est bon j'ai capté mtn, merci @luv94 ! Edited May 13, 2020 by OxyGenS Quote
luv94 Posted May 13, 2020 Posted May 13, 2020 @OxyGenS en fait là d'abord on procéde à un lavage qui va te permettre d'isoler le complexe bille-anticorps-protéines du reste de l'extrait protéique. Ensuite on dissocie l'anticorps et la bille de la protéine A, afin de se retrouver uniquement avec les 2 protéines A et B Après vraiment ne t'embête pas avec les détails, en biotechnologie le tout est de comprendre en gros le principe de chaque méthode et son but! On ne te demandera pas la technique détaillée. Ici retiens que c'est une méthode qui te permet d'analyser les interactions entre 2 protéines, si en faisant une co-immunoprecipitation à partir d'une protéine A et que ça révèle aussi une protéine B tu peux en conclure que B et A interagissent ensemble En sachant ça tu pourras répondre à l'ensemble des QCMs concernant cette technique ne t'inquiète pas Quote
OxyGenS Posted May 13, 2020 Author Posted May 13, 2020 il y a 7 minutes, luv94 a dit : En sachant ça tu pourras répondre à l'ensemble des QCMs concernant cette technique ne t'inquiète pas Très bien merci bcp ! Quote
luv94 Posted May 13, 2020 Posted May 13, 2020 il y a 2 minutes, OxyGenS a dit : Très bien merci bcp ! Avec plaisir! N'hésite pas si jamais tu as d'autres questions! Quote
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