Western blot + dot blot

[OxyGenS]

Re,

 

1) Quand on veut par exemple voir si notre patient a la polyarthrite rhumatoïde, on va prendre de la filaggrine (en prenant un extrait de mb synoviale ?) qu'on met sur la mb et par dessus on y ajoute le sérum du patient. On lave et on révèle avec des Ac 2ndr dirigés contre les Ac anti-filaggrine ?

Est-ce que j'ai dit les bonnes étapes svp ?

2) Est-ce que le western blot de manière général est semi-quantitatif ou il ne l'est que dans le cas de détection de maladies auto-immunes ?

3) Avec le western blot, on ne fait que tester des Ac par rapport à un Ag et pas l'inverse ?

4) J'ai pas bien compris les étapes du dot blotting et pq il est semi-quantitatif ?

5) Pour le dot blot, ça ne se fait que dans un sens : on met un Ag et on met un Ac dont on sait qu'il reconnait l'Ag qu'on cherche puis on met un Ac 2ndr qui reconnait l'Ac primaire ?

6) Le dot blot se faisant sur une mb comment on fait pour avoir des sortes de puits comme sur l'image ? https://zupimages.net/viewer.php?id=20/20/x7fr.png

 

Merci

[Metallica]

Salut 

 

  On 5/12/2020 at 9:40 AM, OxyGenS said:

Quand on veut par exemple voir si notre patient a la polyarthrite rhumatoïde, on va prendre de la filaggrine (en prenant un extrait de mb synoviale ?) qu'on met sur la mb et par dessus on y ajoute le sérum du patient. On lave et on révèle avec des Ac 2ndr dirigés contre les Ac anti-filaggrine ?

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Ouaip

 

  On 5/12/2020 at 9:40 AM, OxyGenS said:

2) Est-ce que le western blot de manière général est semi-quantitatif ou il ne l'est que dans le cas de détection de maladies auto-immunes ?

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Il l'est tout le temps 

 

  On 5/12/2020 at 9:40 AM, OxyGenS said:

3) Avec le western blot, on ne fait que tester des Ac par rapport à un Ag et pas l'inverse ?

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Ben l'intérêt du western blot c est que tu as des bandes pouvant t indiquer si les Ac que tu utilises sont bien spécifiques de Ag qu ils sont censés reconnaître du coup quand tu fais l'etape inverse tu perds cet avantage (les Ig ayant un Pm relativement similaire) et tu ne cibles plus rien 

 

  On 5/12/2020 at 9:40 AM, OxyGenS said:

J'ai pas bien compris les étapes du dot blotting et pq il est semi-quantitatif ?

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La seule diff avec le WB c est qu ici tu ne fais rien migrer, mais comme pour l autre technique, tu as des bandes (d'ou le blot) dont l'epaisseur donne un ordre d'idee de la quantité d'espece révélée mais ne representant pas une source exacte de mesure d'où le semi quantitatif. 

 

  On 5/12/2020 at 9:40 AM, OxyGenS said:

Pour le dot blot, ça ne se fait que dans un sens : on met un Ag et on met un Ac dont on sait qu'il reconnait l'Ag qu'on cherche puis on met un Ac 2ndr qui reconnait l'Ac primaire ?

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L'immunodetection se fait comme pour le WB oui. 

 

  On 5/12/2020 at 9:40 AM, OxyGenS said:

) Le dot blot se faisant sur une mb comment on fait pour avoir des sortes de puits comme sur l'image

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Je sais pas si on peut parler de puits mais cet aspect circulaire s'obtient parce qu'on dépose une goutte de solution protéique (qui ne migrera pas du coup) 

[OxyGenS]

  On 5/12/2020 at 10:56 AM, Metallica said:

  On 5/12/2020 at 9:40 AM, OxyGenS said:

Quand on veut par exemple voir si notre patient a la polyarthrite rhumatoïde, on va prendre de la filaggrine (en prenant un extrait de mb synoviale ?) qu'on met sur la mb et par dessus on y ajoute le sérum du patient. On lave et on révèle avec des Ac 2ndr dirigés contre les Ac anti-filaggrine ?

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Ouaip

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Tu peux confirmer qu'on prend bien de la mb synoviale stp ?

 

  On 5/12/2020 at 10:56 AM, Metallica said:

  On 5/12/2020 at 9:40 AM, OxyGenS said:

J'ai pas bien compris les étapes du dot blotting et pq il est semi-quantitatif ?

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La seule diff avec le WB c est qu ici tu ne fais rien migrer, mais comme pour l autre technique, tu as des bandes (d'ou le blot) dont l'epaisseur donne un ordre d'idee de la quantité d'espece révélée mais ne representant pas une source exacte de mesure d'où le semi quantitatif. 

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On voit réellement l'épaisseur ou c'est la couleur qui sera plus ou moins foncée qui va nous indiquer la qte d'espèce ?

Du coup on va voir si au niv de telle goutte de l'extrait protéique on a bcp d'Ag qui présentent l'épitope reconnu par l'Ac primaire déposé sur la mb ?

Puisqu'on ne fait pas migrer, on ne met pas de SDS donc les protéines ne sont pas dénaturées et donc les épitopes conformationnels peuvent être reconnus ?

 

  On 5/12/2020 at 10:56 AM, Metallica said:

 

  On 5/12/2020 at 9:40 AM, OxyGenS said:

) Le dot blot se faisant sur une mb comment on fait pour avoir des sortes de puits comme sur l'image

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Je sais pas si on peut parler de puits mais cet aspect circulaire s'obtient parce qu'on dépose une goutte de solution protéique (qui ne migrera pas du coup) 

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Mais quand on va laver pour enlever les Ac primaires qui ne se sont pas fixés, on ne risque pas de tout mélanger ?

Est-ce que les protéines qui sont déposées sur la mb s'accrochent à celle-ci y compris pour le WB ?

[Metallica]

  On 5/12/2020 at 11:53 AM, OxyGenS said:

Tu peux confirmer qu'on prend bien de la mb synoviale stp ?

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Pour cette maladie oui 

 

  On 5/12/2020 at 11:53 AM, OxyGenS said:

On voit réellement l'épaisseur ou c'est la couleur qui sera plus ou moins foncée qui va nous indiquer la qte d'espèce ?

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Oui tu as raison c est ça on n a pas de bande pardon c'est l intensité du signal qui donne un ordre d'idée ( blot c'était plutôt dans le sens tache je me suis mal exprimée) 

 

  On 5/12/2020 at 11:53 AM, OxyGenS said:

Du coup on va voir si au niv de telle goutte de l'extrait protéique on a bcp d'Ag qui présentent l'épitope reconnu par l'Ac primaire déposé sur la mb

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Yup ;))

 

  On 5/12/2020 at 11:53 AM, OxyGenS said:

Puisqu'on ne fait pas migrer, on ne met pas de SDS donc les protéines ne sont pas dénaturées et donc les épitopes conformationnels peuvent être reconnus

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Tout à fait 

 

  On 5/12/2020 at 11:53 AM, OxyGenS said:

Mais quand on va laver pour enlever les Ac primaires qui ne se sont pas fixés, on ne risque pas de tout mélanger ?

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Pourquoi ça se melangerait ? 

 

  On 5/12/2020 at 11:53 AM, OxyGenS said:

Est-ce que les protéines qui sont déposées sur la mb s'accrochent à celle-ci y compris pour le WB

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Ouaip sinon ça serait assez embêtant puisque t'aurais plus rien à observer à la fin  x)

 

Edited May 12, 2020 by Metallica

[OxyGenS]

  On 5/12/2020 at 12:26 PM, Metallica said:

Pourquoi ça se melangerait ? 

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Jsp c'était confus dans ma tête mais avec la réponse suivante c'est bon j'ai compris

 

Merci bcp c'est plus clair mtn !

[Metallica]

Et de rien ;))

[OxyGenS]

@Metallica Une ptite question en plus si ça te dérange pas :

Pour le WB et le dot blotting, dans le poly ils sont classés avec les méthodes qualitatives mais sont semi-quantitatifs. Est-ce que c'est une "sous-catégorie" des méthodes qualitatives ? Est-ce qu'en QCM si on a "le WB et dot blotting sont des méthodes qualitatives", on compte vrai ou faux stp ?

[Metallica]

  On 5/12/2020 at 1:22 PM, OxyGenS said:

our le WB et le dot blotting, dans le poly ils sont classés avec les méthodes qualitatives mais sont semi-quantitatifs. Est-ce que c'est une "sous-catégorie" des méthodes qualitatives ?

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En fait le semi-quantitatif c'est quelque chose de "secondaire" dans ces techniques, le but principal étant la révélation des interactions entre Ac-Ag (qualitatif donc)

 

  On 5/12/2020 at 1:22 PM, OxyGenS said:

le WB et dot blotting sont des méthodes qualitatives", on compte vrai ou faux

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Vrai du coup (c'est ce qui est marqué dans le cours faut par chercher trop loin)

[OxyGenS]

D'acc merci @Metallica