Ac secondaire marqué par enzyme

[OxyGenS]

Bonjour !

 

Qqun peut me récapituler quand est-ce que l'enzyme de l'Ac 2ndr (une fois fixé sur l'Ac primaire) transforme le substrat incolore et insoluble en produit coloré et soluble ou insoluble ?

Je me perds entre toutes les options possibles. J'aimerais bien que vous me les réexpliquiez svp

 

Merci

 

[dupuyadèle]

Salut @OxyGenS! 

 

Le substrat incolore et soluble est transformé en produit coloré soluble pour les méthodes quantitatives, et en produit coloré insoluble pour les méthodes morphologiques.

Parmi les méthodes morphologiques, tu as par exemple l'immunohistologie et l'immunocytologie pour localiser un AG dans un tissu ou une cellule, l'immunotranfert, le dot blotting ou encore l'ELISpot. Dans ces méthodes, il faut que ton marquage reste sur place d'où l'utilisation d'un produit insoluble. Les méthodes quantitatives reposent sur la mesure de la densité optique du milieu, donc le produit issu de la transformation enzymatique doit être soluble dans ce milieu. C'est le cas des réactions en phase homogène, de l'ELISA, de l'ELISA indirect, du Cell-ELISA par exemple. 

 

[OxyGenS]

Merci bcp @dupuyadèle !

[OxyGenS]

Je reviens vers toi, j'ai qques incompréhensions

 

Si j'ai bien compris les méthodes morphologiques sont les méthodes qualitatives ?

Le 12/05/2020 à 12:10, dupuyadèle a dit :

Parmi les méthodes morphologiques, tu as par exemple [...] l'ELISpot

Mais l'ELISpot est une méthode quantitative pourtant. Cependant le substrat doit être insoluble pour permettre la numération les cellules sécrétrices ?

 

Le 12/05/2020 à 12:10, dupuyadèle a dit :

C'est le cas des réactions en phase homogène, de l'ELISA, de l'ELISA indirect, du Cell-ELISA par exemple. 

J'avais compris que toutes les réactions ELISA étaient des phases hétérogènes...

 

Edit :

@Ratus la tutrice ne s'est pas connectée depuis un moment, je t'identifie si jamais tu peux répondre

Edited May 25, 2020 by OxyGenS

[Ratus]

Coucou!

 

Il y a 7 heures, OxyGenS a dit :

Mais l'ELISpot est une méthode quantitative pourtant. Cependant le substrat doit être insoluble pour permettre la numération les cellules sécrétrices ?

Alors ici on a un désaccord, personnellement j'avais uniquement retenu que l'on avait un substrat soluble qui se transforme en produit insoluble et je n'avais jamais eu à m'en plaindre... Tu vois où dans le cours que ce n'est pas le cas?

 

Il y a 7 heures, OxyGenS a dit :

J'avais compris que toutes les réactions ELISA étaient des phases hétérogènes...

ici ne t'inquiète pas, je ne me souviens pas avoir déjà vu un piège là-dessus, à tel point que je n'avais pas appris la différence! Mais après un regard dans mes notes, il n'y a que deux techniques en phase hétérogène, l'Elisa tout court (dosage d'Ag) et l'Elisa indirect (dosage d'Ac). Et on dit qu'ils sont hétérogènes car il y a une phase (support) solide !

 

J'espère que ça te va!

 

PS : Et désolé si les réponses sont un peu lentes en ce moment, mais les tuteurs sont en plein examen ce qui fait qu'ils ont un peu moins de temps à accorder au forum!

[OxyGenS]

il y a 29 minutes, Ratus a dit :

Alors ici on a un désaccord, personnellement j'avais uniquement retenu que l'on avait un substrat soluble qui se transforme en produit insoluble et je n'avais jamais eu à m'en plaindre... Tu vois où dans le cours que ce n'est pas le cas?

Mon pb ici est : l'ELISpot est une méthode quantitative pourtant le substrat est bien transformé en produit insoluble. Mais ça ne colle pas avec ce qu'à dit la tutrice la dernière fois...

Le 12/05/2020 à 12:10, dupuyadèle a dit :

Le substrat incolore et soluble est transformé en produit coloré soluble pour les méthodes quantitatives, et en produit coloré insoluble pour les méthodes morphologiques.

Parmi les méthodes morphologiques, tu as par exemple l'ELISpot

 

il y a 29 minutes, Ratus a dit :

ici ne t'inquiète pas, je ne me souviens pas avoir déjà vu un piège là-dessus, à tel point que je n'avais pas appris la différence! Mais après un regard dans mes notes, il n'y a que deux techniques en phase hétérogène, l'Elisa tout court (dosage d'Ag) et l'Elisa indirect (dosage d'Ac). Et on dit qu'ils sont hétérogènes car il y a une phase (support) solide !

D'acc merci !

 

il y a 29 minutes, Ratus a dit :

PS : Et désolé si les réponses sont un peu lentes en ce moment, mais les tuteurs sont en plein examen ce qui fait qu'ils ont un peu moins de temps à accorder au forum!

Oui je sais bien, ce n'était absolument pas un reproche c'est juste que j'ai vu que tu avais répondu 10min avant du coup je me suis permise de t'identifier (dsl si c'était déplacé)

Bon courage pour tes exams !

Edited May 25, 2020 by OxyGenS

[Ratus]

Il y a 15 heures, OxyGenS a dit :

Mon pb ici est : l'ELISpot est une méthode quantitative pourtant le substrat est bien transformé en produit insoluble. Mais ça ne colle pas avec ce qu'à dit la tutrice la dernière fois...

Oui c'est ce que je dis: je suis en désaccord avec la tutrice, pour moi toutes les techniques qu'on a appris parle uniquement d'un substrat soluble transformé en produit insoluble. @dupuyadèle si tu veux rebondir?

 

Il y a 15 heures, OxyGenS a dit :

Oui je sais bien, ce n'était absolument pas un reproche c'est juste que j'ai vu que tu avais répondu 10min avant du coup je me suis permise de t'identifier (dsl si c'était déplacé)

Non non ce n'était pas déplacé, tu as bien fait!

[OxyGenS]

il y a une heure, Ratus a dit :

Oui c'est ce que je dis: je suis en désaccord avec la tutrice, pour moi toutes les techniques qu'on a appris parle uniquement d'un substrat soluble transformé en produit insoluble

Pardon je n'avais pas bien compris ta réponse

 

Après, souvent ils interrogent pas trop sur ça non ?

[Ratus]

à l’instant, OxyGenS a dit :

Après, souvent ils interrogent pas trop sur ça non ?

ça peut leur arriver, mais je n'ai jamais eu à me plaindre de ma réponse "substrat soluble transformé en produit insoluble"

[OxyGenS]

il y a 43 minutes, Ratus a dit :

ça peut leur arriver, mais je n'ai jamais eu à me plaindre de ma réponse "substrat soluble transformé en produit insoluble"

D'acc merci !

[FromageDeChèvre]

Salut

Je me permets de participer à ce sujet pour dire qu'il est bien marqué dans le poly que pour les dosages immunoenzymologiques ou immunoenzymatiques (partie II. D. 2.) : "On utilise comme substrat un chromogène soluble donnant un produit coloré soluble" (page 27 du poly, dans le principe général juste après le titre du 2.)

 

Du coup je ne suis pas d'accord avec ce que tu as dit @Ratus ...

 

Edited May 26, 2020 by FromageDeChèvre

[OxyGenS]

@FromageDeChèvre

Du coup pour toutes les méthodes quantitatives, on a un produit soluble sauf ELISpot pcq on doit numérer ?

Par contre pour toutes les méthodes qualitatives, on a à la fin un produit insoluble ? Si oui (et c'est ce qu'avait dit la tutrice), pq en dot blotting on aurait besoin que ce soit insoluble ?

[FromageDeChèvre]

D'après ce que j'ai compris, il faut retenir que produit coloré soluble pour les méthodes ELISA (sandwich, compétitif, indirect, et Cell-ELISA) afin de pouvoir mesurer la DO.

Pour toutes les autres méthodes c'est produit coloré insoluble (donc ELISpot et dot blotting).

 

Je ne sais pas vraiment pourquoi, mais je pense que c'est parce qu'on ne doit pas mesurer de DO en dot blotting. Et en plus c'est une variante de l'immunotransfert, du coup on garde le même principe (mais là je ne suis pas du tout sûre de cette explication sur le pq du produit insoluble en dot blotting).

Edited May 26, 2020 by FromageDeChèvre

[Ratus]

Mmmh c'est possible en effet. La DO doit être l'explication, car il n'est pas illogique avec le fait qu'on mesure ce qui est produit pour mesurer les interaction. Cette fois, je suis en défaut.

Cependant ne vous cassez pas trop la tête, cette question tombe très rarement, et quand elle tombe c'est plus pour le marquage de coupes (où là c'est clairement soluble qui devient insoluble). Si vous en êtes à vous poser ces questions, c'est qu'il y a des chances que vous maitrisiez les sujets plus communs comme quelle technique est compétitif, quelle technique détecte des Ac donc que vous maitrisez très bien cette partie là. (Ceci étant ce n'est pas une raison pour ne pas se poser des questions de détails, et n'hésitez pas si vous en avez d'autres, très généralement on sait répondre!)

[OxyGenS]

il y a une heure, FromageDeChèvre a dit :

il faut retenir que produit coloré soluble pour les méthodes ELISA (sandwich, compétitif et indirect)

Et aussi Cell-ELISA non ?

 

Merci @Ratus @FromageDeChèvre !

[FromageDeChèvre]

il y a 8 minutes, OxyGenS a dit :

Et aussi Cell-ELISA non ?

 

Oui pardon j'avais oublié, colorant soluble aussi pour cell-ELISA

(je le rajoute dans mon message antérieur)

[OxyGenS]

@FromageDeChèvre si tu veux bien j'ai une autre question : pour la co-immunoprecipitation, on peut préalablement radiomarquer B (je reprends l'exemple du poly, bas de la p25) ? Et du coup après révéler par autoradiographie comme pour l'immunoprecipitation normale ?

[FromageDeChèvre]

Bonjour @OxyGenS

Alors, j'avoue je ne sais pas, mais je ne vois pas de problème à le faire comme tu dis, du coup pourquoi pas ^^

Après, dans le cas où ce serait possible, je ne pense pas qu'elle le pose en QCM puisque si ce n'est pas marqué dans le poly nous on ne peut pas savoir que ça peut se faire et on compterait l'item faux.

 

[OxyGenS]

@FromageDeChèvre

Du coup la seule façon qu'on doit retenir c'est la reconnaissance par un Ac anti-B ? On est d'accord qu'on doit connaître quelles protéines sont censées interagir avec A sinon impossible de détecter ?

 

Il y a 10 heures, OxyGenS a dit :

pour la co-immunoprecipitation, on peut préalablement radiomarquer B (je reprends l'exemple du poly, bas de la p25) ? Et du coup après révéler par autoradiographie comme pour l'immunoprecipitation normale ?

@Ratus pourrais-tu confirmer stp ?

[FromageDeChèvre]

il y a une heure, OxyGenS a dit :

On est d'accord qu'on doit connaître quelles protéines sont censées interagir avec A sinon impossible de détecter ?

On est bien d'accord

[OxyGenS]

il y a 21 minutes, FromageDeChèvre a dit :

On est bien d'accord

Merci !

[OxyGenS]

Le 26/05/2020 à 22:21, OxyGenS a dit :

pour la co-immunoprecipitation, on peut préalablement radiomarquer B (je reprends l'exemple du poly, bas de la p25) ? Et du coup après révéler par autoradiographie comme pour l'immunoprecipitation normale ?

@Ratus Quand tu as un moment, tu pourrais me dire si c'est possible ça stp ?

[Ratus]

@OxyGenS Je n'ai malheureusement pas mon poly avec moi donc je n'ai pas l'image précise, mais si c'est bien la question l'Ac secondaire peut être marqué par à peu  prêt n'importe quoi : radiomarquage, enzyme de conversion, bille magnétique... Tout l'intérêt est que l'Ac primaire reconnaisse la protéine d'intérêt puis sois lui-même reconnu par l'Ac secondaire qui sera à son tour révélé ! Indirectement, on révèle donc la protéine d'intérêt! C'était bien la question?

[OxyGenS]

Salut @Ratus !

Non ça n'était pas ma question^^

En fait lors de l'immunoprécipitation (Ip) on a 2 possibilités soit on fait un marquage radioactif au préalable de qques AA sur l'Ag et du coup on révèlera l'Ag par autoradiographie. Soit on ne radiomarque pas et du coup il faudra révéler par reconnaissance de l'Ag par un Ac spécifique.

Je te remets rapidement l'exemple du cours sur la Co-Ip : on fait précipiter la protéine A. Une autre protéine, la protéine B est liée à A. Pour la révélation, on cherche à révéler B comme ça on est sûr qu'on a bien précipiter des protéines A liées à B.

Ma question est : est-ce que pour la co-Ip, on peut faire pareil que pour l'Ip mais en radiomarquant la protéine B et ensuite révéler par autoradiographie ou ça ne se fait pas (et donc on n'utilise que des Ac) ?

[Ratus]

D'accord! Du coup théoriquement oui on peux, rien ne l'empêche, cependant je ne me souviens pas avoir vu trace d'une telle question en annale. Ça doit être une manière de faire trop détournée, du coup la professeure évite de la poser pour ne pas perdre les élèves.