Clonage hybridomes & autres

[OxyGenS]

Salut,

 

1) Qqun voudrait bien me réexpliquer cette étape svp ?

C'est écrit : "une seule fusion peut aboutir à plusieurs centaines de puits contenant chacun de multiples hybridomes sécréteurs d'Ac de spécificité différente.Il est donc indispensable de cloner les cellules provenant de chaque puits".

Quand on dit une seule fusion ça veut dire quoi ? Pour moi ça signifie 1 seul lymphocyte fusionne avec 1 seule cellule myélomateuse => 1 seul hybridome. Du coup je comprends pas la phrase. Est-ce que en fait ça veut dire qu'on met plein de cellules malignes en présence de tous les lymphocytes récupérés de la rate ?

 

2) Après on en met jusqu'à 1 par puits pour qu'en présence de facteurs de croissance, elles se multiplient ?

 

3) Et après on crible pour ne récupérer que les lignées d'hybridomes qui produisent les Ac qui nous intéressent ?

 

4) Quand on fait un criblage par immunohistochimie, l'enzyme greffée ("PO") à l'Ac 2ndr c'est quoi svp ?

 

5) Pour que les lymphocytes soient HGPRT+, on leur injecte le virus EBV ?

 

Merci d'avance

 

Edited May 7, 2020 by OxyGenS

[Metallica]

Salut

 

  On 5/7/2020 at 7:46 AM, OxyGenS said:

Du coup je comprends pas la phrase. Est-ce que en fait ça veut dire qu'on met plein de cellules malignes en présence de tous les lymphocytes récupérés de la rate ?

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Tu as raison c'est bien ça et comme chaque fusion induira une multiplication très importante in fine, cette phrase veut dire :

 

  On 5/7/2020 at 7:46 AM, OxyGenS said:

une seule fusion peut aboutir à plusieurs centaines de puits contenant chacun de multiples hybridomes sécréteurs d'Ac de spécificité différente.Il est donc indispensable de cloner les cellules provenant de chaque puits

Expand  

 

que chaque fusion de par son potentiel prolifératif,fera en sorte que l'on n'ait plus une seul type d'hybridome prédominant sécréteur d'un seul type d'Ac , d'ou la necessité de faire un clonage en dilution limite. (il ne faut pas le comprendre comme "une seule fusion aboutit à des hybridomes identiques sécrétant des Ac de spécificités différentes" auquel cas ça n'aurait pas de sens comme tu l'as dit)

 

  On 5/7/2020 at 7:46 AM, OxyGenS said:

Et aussi après on en met jusqu'à 1 par puits pour qu'en présence de facteurs de croissance, elles se multiplient ?

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La dilution c'est vraiment pour faire en sorte d'obtenir qu'un seul type d'hybridome (monoclonalité++) mais l'incovénient c'est que si on arrive à l'obtenir, l'hybridome,bien que théoriquement immortel, ne pourra pas se développer s'il n'y a pas de matière à lui fournir d’où l'ajout de facteurs de croissance (+ matrice générée par des fibroblastes rajoutés).

 

  On 5/7/2020 at 7:46 AM, OxyGenS said:

Et après on crible pour ne récupérer que les lignées d'hybridomes qui produisent les Ac qui nous intéressent ?

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Le criblage fait suite à celle la dilution limite, et c'est à ce moment là ou l'on va tester la réactivité de l'hybridome que l'on isolé dans le puits

 

  On 5/7/2020 at 7:46 AM, OxyGenS said:

Edit : Quand on fait un criblage par immunohistochimie, l'enzyme greffée ("PO") à l'Ac 2ndr c'est quoi svp ?

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Peroxydase ;))

[OxyGenS]

  On 5/7/2020 at 9:01 AM, Metallica said:

La dilution c'est vraiment pour faire en sorte d'obtenir qu'un seul type d'hybridome (monoclonalité++)

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Je comprends pas là, on fait plein de fusions de lymphocytes (produisant des Ac de spécificité différente) avec les myélomes malins mais après on obtiendrait qu'un seul type d'hybridomes qui produirait qu'un seul type d'Ac ?

 

  On 5/7/2020 at 9:01 AM, Metallica said:

on va tester la réactivité de l'hybridome que l'on isolé dans le puits

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Ça veut dire qu'on va vérifier qu'il produit bien

- soit des Ac contre l'Ag connu (dans la plupart des cas) --> par immunoenzymologie (ELISA ou IFI)

- soit de voir s'il reconnait l'Ag qui n'est pas bien connu et qu'on veut décrire --> par immunohistochimie (PO) ?

 

J'ai ajouté une question entre tps :

  On 5/7/2020 at 7:46 AM, OxyGenS said:

5) Pour que les lymphocytes soient HGPRT+, on leur injecte le virus EBV ?

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J'ai pas bien compris l'intérêt d'ajouter ce virus dans les lymphocytes avant de les hybrider

[Metallica]

  On 5/7/2020 at 9:11 AM, OxyGenS said:

u'un seul type d'hybridomes qui produirait qu'un seul type d'Ac ?

Expand  

 

un seul type d'hybridome par puits

 

 

 

  On 5/7/2020 at 9:11 AM, OxyGenS said:

Ça veut dire qu'on va vérifier qu'il produit bien

- soit des Ac contre l'Ag connu (dans la plupart des cas) --> par immunoenzymologie (ELISA ou IFI)

- soit de voir s'il reconnait l'Ag qui n'est pas bien connu et qu'on veut décrire --> par immunohistochimie (PO) ?

Expand  

 

Ouaip après immunoenzymatique et immunohistochimie c'est pas exclusif c'est-à-dire qu'en immunohistochimie on peut utiliser des techniques immunoenzymatiques

 

 

  On 5/7/2020 at 9:11 AM, OxyGenS said:

'ai pas bien compris l'intérêt d'ajouter ce virus dans les lymphocytes avant de les hybrider

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Ou-est ce que c'est marqué dans le cours ?

[OxyGenS]

  On 5/7/2020 at 9:28 AM, Metallica said:

Ou-est ce que c'est marqué dans le cours ?

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p18 dans "3. Ac monoclonaux humains" --> "a. Méthode classique" ; c'est le schéma où on voit chaque étape dessinée

 

Si ça te dérange pas j'ai une autre question :

Pour éviter la réaction croisée avec un As, on fait une 2ère chromato avec les anti-X (imaginons que l'Ag est X) et les anti-X qui sont aussi anti-Y. Dans cette chromato du coup on met sur la bille de sépharose l'Ag Y comme ça on ne récupère que le "vrai" Ac anti-X.

Ce que je comprends pas c'est comment savoir que l'anti-Y est contre l'Ag Y justement et donc faire cette 2ème chromato en choisissant l'Ag Y ?

Est-ce que c'est pcq on connait les Ac qui ont des paratopes semblables et du coup on est capable de déterminer les Ag qu'ils reconnaissent ?

[Metallica]

  On 5/7/2020 at 9:36 AM, OxyGenS said:

p18 dans "3. Ac monoclonaux humains" --> "a. Méthode classique" ; c'est le schéma où on voit chaque étape dessinée

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ah okey c'est bon je l'ai

 

Du coup j'ai cherché et ça à l'air de conférer une immortalité aux lymphocytes infectés (peut-etre pour s'assurer que les hybridomes ne succomberont pas par apoptose après fusion)

 

  On 5/7/2020 at 9:36 AM, OxyGenS said:

Pour éviter la réaction croisée avec un As, on fait une 2ère chromato avec les anti-X (imaginons que l'Ag est X) et les anti-X qui sont aussi anti-Y. Dans cette chromato du coup on met sur la bille de sépharose l'Ag Y comme ça on ne récupère que le "vrai" Ac anti-X.

Ce que je comprends pas c'est comment savoir que l'anti-Y est contre l'Ag Y justement et donc faire cette 2ème chromato en choisissant l'Ag Y ?

Est-ce que c'est pcq on connait les Ac qui ont des paratopes semblables et du coup on est capable de déterminer les Ag qu'ils reconnaissent ?

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on ne peut pas le savoir par une simple chromatographie d'affinité, il faut utiliser des techniques comme le Western-Blot. Avec ça, tu pourras établir de manière claire s'il y a une réaction croisée

Edited May 7, 2020 by Metallica

[OxyGenS]

  On 5/7/2020 at 10:04 AM, Metallica said:

on ne peut pas le savoir par une simple chromatographie d'affinité, il faut utiliser des techniques comme le Western-Blot. Avec ça, tu pourras établir de manière claire s'il y a une réaction croisée

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Ma question c'est plutôt : une fois qu'on sait qu'il y a une réaction croisée, comment savoir que cette réaction a eu lieu avec tel Ac qui reconnaît plus spécifiquement tel Ag (dans mon exemple Ac anti-Y qui reconnaît Y) et du coup comment faire pour trouver l'Ag qu'on va ensuite mettre sur la phase stationnaire pour ne pouvoir récupérer que l'Ac qui nous intéresse (dans mon exemple l'Ac anti-X) ?

 

Tu comprends ma question ou c'est tjs pas clair ?

Edited May 7, 2020 by OxyGenS

[Metallica]

 

  On 5/7/2020 at 11:54 AM, OxyGenS said:

une fois qu'on sait qu'il y a une réaction croisée, comment savoir que cette réaction a eu lieu avec tel Ac qui reconnaît plus spécifiquement tel Ag

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C'est l'inverse, c'est en testant ton antisérum (dont la synthèse a été stimulé par un Ag X) en WB que tu vas pouvoir t’apercevoir qu'il y a une bande qui ne correspondra pas à X. à partir de là, tu te débrouilles pour isoler l'Ag qui a occasionné la réaction croisée (par un autre Ac dont tu sais qu'il est spécifique de l'Ag Y). Ensuite tu disposes ton Ag Y sur la colonne pour te débarrasser des Ac-anti X-Y.

Edited May 7, 2020 by Metallica

[OxyGenS]

  On 5/7/2020 at 12:40 PM, Metallica said:

C'est l'inverse, c'est en testant ton antisérum (dont la synthèse a été stimulé par un Ag X) en WB que tu vas pouvoir t’apercevoir qu'il y a une bande qui ne correspondra pas à X

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Dsl je suis pénible un peu mais je comprends pas bien. Qu'est-ce qu'on aura comme bandes sur la mb ? Si ça te dérange pas, je veux bien que tu fasses un schéma vite fait pour que je visualise mieux.

 

  On 5/7/2020 at 12:40 PM, Metallica said:

à partir de là, tu te débrouilles pour isoler l'Ag qui a occasionné la réaction croisée (par un autre Ac dont tu sais qu'il est spécifique de l'Ag Y).

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Comment savoir quel est l'Ag qui possède le même épitope que X et qui engendre la réaction croisée ?

[Metallica]

  On 5/7/2020 at 12:55 PM, OxyGenS said:

Dsl je suis pénible un peu mais je comprends pas bien. Qu'est-ce qu'on aura comme bandes sur la mb ? Si ça te dérange pas, je veux bien que tu fasses un schéma vite fait pour que je visualise mieux.

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Imaginons, tu injectes un Ag X de 60kDa dans une souris puis tu récupères l'Antiserum supposé être dirigé contre cet ag X. Tu fais ton western-blot avec un extrait protéique contenant ton Ag X, l'As supposé être anti-X et des Ac secondaires marqués anti-As. Normalement si l'As est bien anti-X, tu n'auras que des bandes à 60kDa.Si tu as des bandes de PM différents, tu auras possiblement affaire à une réaction croisée. Imaginons qu il y ait une bande à 90kDa correspondant à un Ag Y , tu vas te débrouiller pour identifier cet Ag Y (cristallographie, electrophorese bidimensionnelle pour connaître son Phi, directement l'identifier par rapport au tissu dont elle provient +son pm....)

et une fois tout ceci fait, tu te debrouilleras pour isoler ton Ag Y (par des techniques immunologiques ou autres), tu le disposeras sur ta colonne et tu pourras déposé l'As qui sera débarrassé des Ac anti X-Y 

 

 

Edited May 7, 2020 by Metallica

[OxyGenS]

Okkk c'est bon j'ai compris, merci bcp @Metallica

[Metallica]

de rien avec plaisir ;))