Méthodes chromato

[OxyGenS]

Bonjour !

 

1) https://zupimages.net/viewer.php?id=20/18/9jnn.png

Dans cette méthode (chromato échangeuse d'ions), je ne comprends pas comment se fait le fractionnement des protéines...

J'ai noté que cela se fait selon l'affinité des protéines pour la phase stationnaire mais techniquement je ne vois pas comment c'est réalisé.

 

2) Pour la chromato par gel filtration : le prof a détaillé cette année les natures possibles du gel ?

La relation entre masse moléculaire et le Ve relatif est une relation inverse pcq les grosses protéines seront éluées avec un petit Ve relatif ?

Vous pouvez me réexpliquer pq Ve relatif = Ve/V0 svp ?

 

3) Pour la chromato d'affinité : la phase stationnaire est tjs composée de billes de sépharose ?

 

Merci d'avance

Edited April 27, 2020 by OxyGenS

[Cla-098]

Salut OxyGenS!

Alors pour toutes ces méthodes, je te conseille vraiment de bien visualiser la technique avec les schémas du prof: 

 

1) Pour la chromatographie échanges d'ions, la phase stationnaire fixée le long de la colonne est chargée (soit positivement pour les échangeuses d'anions, soit négativement pour les échangeuses de cations). Quand tu mets ton mélange à séparer dans la colonne, les molécules de charges opposées à la phase stationnaire vont se fixer à celle-ci. Tu récupères donc d'abord, après lavage, les molécules de même charge que la phase stationnaire. Ce n'est qu'après modification des conditions physico-chimiques (pH) avec des solutions NaCl que tu procèdes à l'élution et que tu récupères tes molécules précédemment fixées sur le colonne. 

Je te mets également un deuxième schéma peut-être plus simpliste et visuel: 

 

2) Pour la chromatographie par gel filtration : concernant ta première question, j'avoue que je ne sais pas ce qu'il a davantage détaillé, toutefois c'est la partie du professeur Levade, or ce n'est vraiment pas dans son habitude d'accorder de l'importance à ça dans ses qcms. Je peux bien sûr me tromper, mais vraiment il n'a jamais piégé sur les natures du gel à ma connaissance.

Concernant le volume d'élution, dans cette technique, comme tu peux le voir sur le schéma, ce sont les grosses molécules que tu vas récupérer en premier, les petites vont être retardées dans les billes. Ainsi le volume Ve relatif, volume d'élution propre de chaque molécule, sera petit pour les grosses molécules, et grand pour les petites puisqu'elles sortiront en dernier.

V0 étant le volume mort, c'est Ve qui varie.

 

3) Pour la chromatographie d'affinité, d'après le site de http://biochimej.univ-angers.fr, les billes peuvent être d'agarose (sepharose), de polyacrylamide d'agarose, de verre poreux... Dans les qcms, il parle bien souvent de sepharose, mais de là à dire toujours, je ne sais pas... Après comme précédemment, Levade n'a vraiment pas pour habitude de s'intéresser à ça en qcms, donc j'aurais tendance à te conseiller de ne pas trop t'y attarder  

 

J'espère que c'est plus clair pour toi, sinon n'hésite pas!

 

La tutobise de loin  

 

[OxyGenS]

il y a 9 minutes, Cla-098 a dit :

1) Pour la chromatographie échanges d'ions, la phase stationnaire fixée le long de la colonne est chargée (soit positivement pour les échangeuses d'anions, soit négativement pour les échangeuses de cations). Quand tu mets ton mélange à séparer dans la colonne, les molécules de charges opposées à la phase stationnaire vont se fixer à celle-ci. Tu récupères donc d'abord, après lavage, les molécules de même charge que la phase stationnaire. Ce n'est qu'après modification des conditions physico-chimiques (pH) avec des solutions NaCl que tu procèdes à l'élution et que tu récupères tes molécules précédemment fixées sur le colonne. 

Ok en fait fractionnement = formation de groupes de protéines lors de l'élution en fct de leur charge ?

 

il y a 11 minutes, Cla-098 a dit :

Concernant le volume d'élution, dans cette technique, comme tu peux le voir sur le schéma, ce sont les grosses molécules que tu vas récupérer en premier, les petites vont être retardées dans les billes. Ainsi le volume Ve relatif, volume d'élution propre de chaque molécule, sera petit pour les grosses molécules, et grand pour les petites puisqu'elles sortiront en dernier.

V0 étant le volume mort, c'est Ve qui varie.

Je sais que le V0 est le volume présent avant tout début d'élution. Mais après je comprends plus pq on fait un Ve relatif. Tu peux me réexpliquer stp ?

 

Le reste c'est ok merci !

[Metallica]

Il y a 7 heures, OxyGenS a dit :

Je sais que le V0 est le volume présent avant tout début d'élution. Mais après je comprends plus pq on fait un Ve relatif. Tu peux me réexpliquer stp ?

 

ça permet de mettre en place une estimation de la masse moléculaire des protéines éluées via une échelle logarithmique. En gros à un certain log de MM est associé une valeur y par la fonction Ve/V0. Avec ça tu construis une courbe "type" qui te permettras, quand tu auras mesuré tes Ve et Vo, de trouver le MM par correspondance à la valeur de ce volume relatif reportée sur la courbe.

 

Plus ce volume relatif sera grand plus la MM de la prot sera petite et inversement.

 

Il y a 7 heures, OxyGenS a dit :

Ok en fait fractionnement = formation de groupes de protéines lors de l'élution en fct de leur charge ?

 

Yup de leur charge et aussi du nombre de charge qui va aussi jouer

[OxyGenS]

il y a 40 minutes, Metallica a dit :

ça permet de mettre en place une estimation de la masse moléculaire des protéines éluées via une échelle logarithmique. En gros à un certain log de MM est associé une valeur y par la fonction Ve/V0. Avec ça tu construis une courbe "type" qui te permettras, quand tu auras mesuré tes Ve et Vo, de trouver le MM par correspondance à la valeur de ce volume relatif reportée sur la courbe.

 

Plus ce volume relatif sera grand plus la MM de la prot sera petite et inversement.

J'ai mal formulé mon pb dsl. En fait je ne sais plus pq on divise le Ve (donc qui est récupéré dans le tube en dessous) par le V0... C'est pour déduire le Volume qu'on a réellement ajouté ? Si oui pq c'est une division et non pas une soustraction ?

C'est pas hyper clair mais j'ai du mal à expliquer

 

il y a 42 minutes, Metallica a dit :

Yup de leur charge et aussi du nombre de charge qui va aussi jouer

Oui c'est vrai, merci !

[OxyGenS]

Il y a 23 heures, OxyGenS a dit :

En fait je ne sais plus pq on divise le Ve (donc qui est récupéré dans le tube en dessous) par le V0... C'est pour déduire le Volume qu'on a réellement ajouté ? Si oui pq c'est une division et non pas une soustraction ?

C'est pas hyper clair mais j'ai du mal à expliquer

Qqun svp ?

[Cla-098]

Désolée OxyGenS, je n'avais pas vu! 

Alors je suis bien d'accord avec les réponses de Metallica! 

Concernant ta dernière question, le V0 est le volume de référence (d'une molécule non retardée, qui ne diffuserait pas car de taille supérieure aux billes) qui ne pourrait surtout de traçer une droite étalon avec les valeurs des Ve. Pour construire cette droite, il te faut un rapport, d'où la division.

Ainsi, on peut déterminer le volume d'élution et donc ensuite la masse molaire d'une molécule inconnue.

Je ne sais pas si cela répond à ta question

[OxyGenS]

Il y a 7 heures, Cla-098 a dit :

Désolée OxyGenS, je n'avais pas vu! 

Pas de souci

 

Il y a 7 heures, Cla-098 a dit :

Alors je suis bien d'accord avec les réponses de Metallica! 

Concernant ta dernière question, le V0 est le volume de référence (d'une molécule non retardée, qui ne diffuserait pas car de taille supérieure aux billes) qui ne pourrait surtout de traçer une droite étalon avec les valeurs des Ve. Pour construire cette droite, il te faut un rapport, d'où la division.

Ainsi, on peut déterminer le volume d'élution et donc ensuite la masse molaire d'une molécule inconnue.

Je ne sais pas si cela répond à ta question

Ok merci bcp !