OxyGenS Posted April 6, 2020 Posted April 6, 2020 Salut, Qqun voudrait bien m'expliquer pour la E svp ? https://zupimages.net/viewer.php?id=20/15/9axy.png https://zupimages.net/viewer.php?id=20/15/gwsc.png Merci Quote
Luciolette Posted April 6, 2020 Posted April 6, 2020 Coucou @OxyGenS, Pour l'item E, c'est faux car avec ces couples d'enzymes il ne pourra pas y avoir de clonage du gène. En effet, le promoteur 1 et 2 t'indique le sens de la transcription. Or puisque Acc65I est compatible avec PaeI et pas avec PaeI donc l'insertion pourra se faire dans un seul sens mais ce sens ne permettra pas l'expression du gène. L'insertion se ferra "à l'envers" : la compatibilité entre les enzymes entrainent une insertion de l'insert dans le sens STOP -> ATG. Es ce que c'est clair ? Bon courage ! Quote
OxyGenS Posted April 6, 2020 Author Posted April 6, 2020 il y a 9 minutes, Luciolette a dit : Pour l'item E, c'est faux car avec ces couples d'enzymes il ne pourra pas y avoir de clonage du gène. J'ai oublié de le mettre dans le 1er msg dsl, mais l'item E est compté vrai... Quote
OxyGenS Posted April 6, 2020 Author Posted April 6, 2020 (edited) Je ne comprends pas un autre item même avec la correction : le 7E (c'est les mêmes insert et plasmide que j'ai mis au tt début) item : https://zupimages.net/viewer.php?id=20/15/oe9m.png correction : https://zupimages.net/viewer.php?id=20/15/ho9b.png Edited April 6, 2020 by OxyGenS Quote
dupuyadèle Posted April 6, 2020 Posted April 6, 2020 Il y a 2 heures, OxyGenS a dit : J'ai oublié de le mettre dans le 1er msg dsl, mais l'item E est compté vrai... @OxyGenS Voilà le lien pour le détail de l'item E, dis moi si c'est bon pour toi http://image.noelshack.com/fichiers/2020/15/1/1586200307-15862002792264764210638920200389.jpg Quote
dupuyadèle Posted April 6, 2020 Posted April 6, 2020 Il y a 2 heures, OxyGenS a dit : Je ne comprends pas un autre item même avec la correction : le 7E (c'est les mêmes insert et plasmide que j'ai mis au tt début) item : https://zupimages.net/viewer.php?id=20/15/oe9m.png correction : https://zupimages.net/viewer.php?id=20/15/ho9b.png Donc l'idée c'est que tu cherches à produire un nombre important de copies de ta séquence d'intérêt. Pour cela, tu procèdes à une recombinaison de l'ADN de ton plasmide avec ton insert, tu transfectes des bactéries avec le plasmide recombinant pour que puisse se répliquer ta séquence d'intérêt . Mais tu peux aussi choisir de récupérer l'ARN qui va être transcrit dans ces bactéries à partir de ta séquence d'intérêt, par exemple pour ensuite le traduire en une protéine particulière. Et donc pour récupérer cet ARN, tu détruits les bactéries avec du détergent et tu fais une ultra centrifugation pour séparer les différents matériaux génétiques présents dans la bactérie : son ADN propre, le plasmide recombinant qu'elle a intégré et les ARN qui ont été transcrits à partir de ce plasmide. Parmi ces 3 sources de matériel génétique, l'ARN est le plus dense d'où le fait que l'item est faux. Quote
OxyGenS Posted April 7, 2020 Author Posted April 7, 2020 Il y a 11 heures, dupuyadèle a dit : Voilà le lien pour le détail de l'item E, dis moi si c'est bon pour toi Il y a 13 heures, Luciolette a dit : c'est faux car avec ces couples d'enzymes il ne pourra pas y avoir de clonage du gène. En effet, le promoteur 1 et 2 t'indique le sens de la transcription. Or puisque Acc65I est compatible avec PaeI et pas avec PaeI donc l'insertion pourra se faire dans un seul sens mais ce sens ne permettra pas l'expression du gène. L'insertion se ferra "à l'envers" : la compatibilité entre les enzymes entrainent une insertion de l'insert dans le sens STOP -> ATG. @dupuyadèle J'ai compris ton explication et dans quel sens ça s'insère mais j'ai pas compris l'explication juste au-dessus... il y a un pb de transcription pour pouvoir cloner ? Il y a 11 heures, dupuyadèle a dit : Parmi ces 3 sources de matériel génétique, l'ARN est le plus dense Je comprends pas pq c'est l'ARN qui est le plus dense Quote
dupuyadèle Posted April 7, 2020 Posted April 7, 2020 @OxyGenS Pour l'histoire de l'ARN, j'ai cherché un peu et voilà ce que j'ai trouvé : lorsque tu fais une ultra centrifugation, tu utilises une solution de Chlorure de césium (ClCs) qui va former un gradient de densité au cours de la centrifugation (basse densité en haut du tube, haute densité en bas du tube). Les molécules de Cs sont chargées positivement et vont interagir avec les acides nucléiques chargés négativement. Comme l'ARN simple brin est plus accessible que l'ADN double brin (pas assez d'espace entre les deux brins pour que beaucoup de molécules de ClCs s'y mettent), le ClCs interagit plus avec l'ARN, le "plombe" plus donc ceci explique sa plus haute densité Et ensuite pour ta deuxième question, pour moi il n'y a pas de problème de sens justement, ça s'insère dans le bon sens de transcription (si tu reprends le schéma que je t'ai mis) donc le gène peut être transcrit sans problème ! Quote
dupuyadèle Posted April 7, 2020 Posted April 7, 2020 Correction : en fait l'insert peut bien être intégré par l'utilisation de ces enzymes dans le plasmide mais c'est vrai qu'on se retrouve avec la partie codon stop côté promoteur et le codon initiation à la fin... Quote
OxyGenS Posted April 7, 2020 Author Posted April 7, 2020 Il y a 6 heures, dupuyadèle a dit : Pour l'histoire de l'ARN, j'ai cherché un peu et voilà ce que j'ai trouvé : lorsque tu fais une ultra centrifugation, tu utilises une solution de Chlorure de césium (ClCs) qui va former un gradient de densité au cours de la centrifugation (basse densité en haut du tube, haute densité en bas du tube). Les molécules de Cs sont chargées positivement et vont interagir avec les acides nucléiques chargés négativement. Comme l'ARN simple brin est plus accessible que l'ADN double brin (pas assez d'espace entre les deux brins pour que beaucoup de molécules de ClCs s'y mettent), le ClCs interagit plus avec l'ARN, le "plombe" plus donc ceci explique sa plus haute densité Ok merci bcp pour tes recherches ! Il y a 4 heures, dupuyadèle a dit : Correction : en fait l'insert peut bien être intégré par l'utilisation de ces enzymes dans le plasmide mais c'est vrai qu'on se retrouve avec la partie codon stop côté promoteur et le codon initiation à la fin... Du coup ça serait impossible de cloner ? Et du coup l'item serait faux ? Quote
Solution dupuyadèle Posted April 7, 2020 Solution Posted April 7, 2020 Il y a 3 heures, OxyGenS a dit : Du coup ça serait impossible de cloner ? Et du coup l'item serait faux ? Alors après discussion avec l'équipe des tuteurs recherche, on est arrivé à la conclusion que pour le clonage, c'est à dire la formation de nombreuses répliques de ta séquence d'intérêt, le sens codon d'initiation --> codon stop n'a pas d'intérêt, puisqu'il ne s'agit pas de traduire la séquence mais seulement de la répliquer. Par contre, il y a bien un errata sur l'item E. En effet, il n'existe pas qu'un seul moyen de digérer l'insert et le vecteur pour que cela fonctionne. Le couple d'enzymes NcoI et PaeI pour la préparation de l'insert et le couple d'enzymes FatI et NlaIII pour la préparation du plasmide fonctionnent également. Voilà, je crois que c'est bon ! Tu valides ? Quote
OxyGenS Posted April 8, 2020 Author Posted April 8, 2020 @dupuyadèle J'ai tout compris ! Merci bcp pour le tps que tu as consacré aux réponses (et merci aux tuteurs Recherche) Quote
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