Insertion dans un sens

[clairecamp21]

Salut!!

Désolée d'encombrer le forum avec cette question posée 10000x mais j'arrive pas à comprendre comment on fait pour savoir si ça peut s'insérer que dans un sens...

J'ai compris comment on fait pour insérer et tout mais je sais pas quand ça ne s'insère dans 1 sens .... voilà si quelqu'un a la gentillesse de vouloir ré-expliquer :)

https://image.noelshack.com/fichiers/2020/14/4/1585849826-capture.png

 

 

Merci :)

 

[Metallica]

Coucou @clairecamp21

 

On va prendre les 4 cas de figures possibles:

 

-un 1er cas ou l'insert n'est digéré que par une seule et même ER (enzyme de restriction) tout comme le plasmide qui sera digéré par une seule ER

-Un 2ème cas ou l'insert est digéré par deux ER différentes et le plasmide par une seule ER.

-Un 3ème cas ou l'insert est digéré par une seule ER et le plasmide est digéré par 2 ER.

-Un dernier cas ou l'insert est digéré par 2 ER et le plasmide par 2 ER.

 

Premier cas le plus simple il faut juste savoir si les sites générés par les ER du plasmide et de l'insert sont compatibles entre eux. Si oui , alors l'insert pourra s'introduire dans les deux sens.

 

Deuxième cas , il faut vérifier la compatibilité des sites des ER du plasmide et de l'une des deux enzymes pour savoir si l'insert pourra s'introduire. Si l'insert peut effectivement s’insérer dans un sens, pour savoir s'il peut s'insèrer dans l'autre sens, il y a deux possibilités : soit tu regardes la compatibilités des sites crées par les 2ER ayant servi à libérer l insert (puisque si les 2 sont compatibles sachant que l'une est compatible avec l'ER du plasmide alors la deuxième ER le sera aussi) soit tu regardes directement la compatibilité du site crée par la 2ème ER (ayant servi à libérer l'insert) avec celui du plasmide.

 

Troisième cas, même chose que le deuxième mais avec les rôles inversés.

 

Dernier cas,  il faut trouver une combinaison qui permettra au plasmide de s'insérer ensuite tu regardes d'une part si les sites générés par les ER au sein du plasmide sont compatibles entre eux et d'autre part si les sites crées par les ER au sein de l'insert sont compatibles entre eux. Si toutes les conditions précédemment citées sont respectées, alors le plasmide pourra s'insérer sinon il ne pourra au maximum s'insérer que dans un seul sens.

 

Voilou

Edited April 3, 2020 by Metallica

[Ratus]

Ça va pour toi @clairecamp21 ?

[clairecamp21]

OK.... alors je suis pas sûre d'avoir tout tout tout compris mais déjà merci !

Faut que je m'entraîne je pense ;)

 

Juste si j'ai bien compris par ex pour l'item C :

- Nhe1

- Bg3

- Xba1

 

Pour le plasmide j'ai :

5' A............CTAGC

3' TCTAG...          G

et du coup si je colle les deux c'est pas compatible vu qu'on aura un C sur un C etc...

 

Pour l'insert j'ai :

5' GATCT.......T..........

3'...........A......AGATC

et là par contre c'est parce qu'on colle AA et TT ???? :(

 

Du coup au final l'insert dans le plasmide c'est :

5' AGATCT....TCTAGC 3'

3' TCTAGA....AGATCG 5'

 

j'espère que c'est pas tout faux mdrr merci pour tes précisions en tous les cas :)

[Metallica]

il y a 40 minutes, clairecamp21 a dit :

Pour le plasmide j'ai :

5' A............CTAGC

3' TCTAG...          G

et du coup si je colle les deux c'est pas compatible vu qu'on aura un C sur un C etc...

 

Pour l'insert j'ai :

5' GATCT.......T..........

3'...........A......AGATC

et là par contre c'est parce qu'on colle AA et TT ???? :

 

Le truc que je t ai dit, c'est pour les cas où on te demande si ça s insère dans les deux sens et en le faisant tu as pu vite voir que ça n'était pas le cas. Par contre si on te demande s'il ne s'insère que dans un seul sens ou juste s'il peut s'insère, Il te faudra vérifier s'il y a une combinaison qui marche ;)) ...ce que tu as fait ici :

 

il y a 44 minutes, clairecamp21 a dit :

Du coup au final l'insert dans le plasmide c'est :

5' AGATCT....TCTAGC 3'

3' TCTAGA....AGATCG 5'

 

 

[clairecamp21]

Il y a 18 heures, Metallica a dit :

Le truc que je t ai dit, c'est pour les cas où on te demande si ça s insère dans les deux sens et en le faisant tu as pu vite voir que ça n'était pas le cas

en fait c'est vraiment ça le pb parce que si je l'ai fait je m'en suis pas rendu compte

je voudrais savoir qu'est-ce-qu'il faut regarder pour être sûr que ça s'insère que dans 1 sens ....

 

merci d'avance

[clairecamp21]

@Ratus je me permet de te relancer :)

[Ratus]

Oups désolé.

Être sûr que ça s'insère dans un sens, je pense que la méthode la plus simple est de regarder les deux extrémités où coupent les enzymes: Si les enzymes coupent des bouts différents, alors (du moment qu'on trouve un endroit où l'insérer dans le vecteur) l'ADN s'insèrera dans un seul sens. Si les deux bouts sont identiques, alors l'ADN pourra s'insérer dans les deux bouts.

ATTENTION: par bout je parle uniquement de ce qu'il y a comme allèle libre (pas des isoschyzomères). Par exemple dans le cas précédent:

5' AGATCT....TCTAGC 3'

3' TCTAGA....AGATCG 5'

le "bout" est CTAG

Ça t'aide ? @clairecamp21

[clairecamp21]

Le 06/04/2020 à 15:50, clairecamp21 a dit :

Pour le plasmide j'ai :

5' A............CTAGC

3' TCTAG...          G

Ok donc comme on avait CTAG d'un côté et A seul de l'autre côté du coup c'est forcément un sens vu que c'est pas les mêmes et en plus c'est une base vs 4 bases ?

 

Merci en tous cas :)

 

Du coup oui ça m'aide @Ratus

[Ratus]

Il y a 22 heures, clairecamp21 a dit :

Ok donc comme on avait CTAG d'un côté et A seul de l'autre côté du coup c'est forcément un sens vu que c'est pas les mêmes et en plus c'est une base vs 4 bases ?

C'est ça, t'a tout compris!

 

De rien, n'hésites pas si tu as d'autres questions!