Recombinaison homologue

[Le-Roi-des-Glaces]

Bien le bonjour,

 

J'ai quelques incompris dans mon cours de recherche

 

Nous avons vu dans le cours sur CRISPR cas9 comment favoriser la recombinaison homologue -> en créant une cassure double brin sur le gène cible.

- Mais alors comment faire de la recombinaison homologue sans CRISPR, tel que présenté lors du cours Bettina Couderc ?

 

Le système CRISPR cas9  utilisé en transgenèse se sert d'une "Endonucléase qui crée une cdb à une distance de 3 nucléotides de la séquence PAM s'il y a un ARN guide"

- La séquence PAM n'est-elle pas un motif viral ? J'ai mal du noter parce que ça compliquerait un peu la chose sur l'homme, non?

 

J'espère avoir été clair 

Dans l'attente de vos conseils éclairés!

[LAmi_Omelette]

Salut @IceKing ! 

Il y a 1 heure, IceKing a dit :

- Mais alors comment faire de la recombinaison homologue sans CRISPR, tel que présenté lors du cours Bettina Couderc ?

Dans le cours de Mme. Couderc on utilise des enzymes de restriction qui ne sont pas la même chose que CRISPR cas9.

 

Il y a 1 heure, IceKing a dit :

- La séquence PAM n'est-elle pas un motif viral ? J'ai mal du noter parce que ça compliquerait un peu la chose sur l'homme, non?

Absolument, PAM est un motif viral qui sera reconnu par la caspase 9. Compliqué chez l'homme ?

[Le-Roi-des-Glaces]

1) Je pensais que les enzymes de restriction servaient à "former" le vecteur recombinant... Elles jouent donc aussi un rôle pour l'intégration du transgène dans l'ADN après la transformation / transfection? 

 

2) Mais comment PAM peut-il être reconnu dans le génome humain s'il s'agit d'un motif viral ? 

 

Merci ^^

[nely31]

1er point: quand tu parles de former le vecteur recombinant on parle d"intégrer l'ADNc dans l'ADN (exemple: dans un plasmide) qui sera ensuite intégré dans une bactérie = transformation (mécanisme non détaillé). Sachant que les plasmides sont retrouvés dans le cytoplasme des bactéries. Donc pas d'enzyme de restriction pour insérer un plasmide dans une bactérie, mais bien pour faire le vecteur comme tu l'as dit.

 

Concernant la recombinaison homologue évoquée par Bettina, je n'ai rien noté par rapport aux enzymes ou système utilisé. Bettina fait uniquement référence à l'hôte producteur et sa sélection après transgenèse. Je suppose que le mécanisme utilisé est celui détaillé par la Pr Monferran. De plus, au début de son cours la Pr Monferran évoque la recombinaison homologue avec un mécanisme qui n'utilise par crispr/cas 9 (sauf si le cours à changé...). Ce sont donc 2 techniques de transgenèse (qui peuvent être mis en parallèle du cours de Bettina) sachant que crispr/cas 9 reste la plus "évoluée".

J’espère que c'est plus clair pour toi!

[nely31]

2ème point: la Pr Monferran vous a mit dans son cours l'exemple de crisp/Cas 9 chez la bactérie, mais je suppose que ça sera pareil chez l'homme (je te conseille de prendre ton cours sous les yeux pour mieux comprendre mes explications). Il faut noter que la 1ere phase est celle d'immunisation:  le  virus qui "porte" le motif PAM va être reconnu comme du Non-Soi lors de l'infection, un fragment de se virus (à la suite de la réaction immunitaire) qui s'appel "spacer" sera inséré dans le génome de l'hôte (homme ou bactérie) ce qui servira de "mémoire".

C'est donc lors de la phase 2: immunité, ce même virus nous ré-attaque, on reconnait donc le même motif PAM,  OR notre organisme qui a ingéré un petit bout de son ADN (spacer) va produire un Pré-crARN qui provient de l'ADN de ce spacer. Après tout un tas de maturation, on a un crARN mature qui va s'HYBRIDER à cette ADN viral!!  De là, paf ça fait des chocapics, la protéine CAS9 va pouvoir agir et couper l'ADN viral en petit bout, ce qui nous débarasse de l'ADN du virus et donc on est IMMUNISE!! On parlera d'interférence.

 

J’espère vraiment que c'est plus clair pour toi!! Sinon n’hésite pas à reposer des questions!

 

Bon courage!

[Le-Roi-des-Glaces]

OK merci!

 

[nely31]

Je reviens sur ce que j'ai dit, ce système est utilisé chez la bactérie pour obtenir l'ADN modifié, qui sera ensuite transfécté dans le zygote (chez les souris pour obtenir des modèles pathologiques, pas chez l'homme). Et qui du coup permettra d’obtenir des modèles KI et KO pour un ADN ciblé. ça sera utile aussi pour produire des molécules thérapeutiques humaines par des animaux.