mutagénèse conditionnelle

[carolineb]

Bonjour, concernant le système Cre-LoxP je ne comprends pas trop à quoi servent les cassettes de sélections. Je pensais qu'elles servaient à cibler la séquence mais pq les enlever à la fin du coup? 

 

et aussi je comprends pas pourquoi on veut absolument obtenir une population homozygote?

 

merci d'avance!

Edited March 2, 2020 by carolineb

[OxyGenS]

@carolineb J'ai pas trop compris ta question dsl, tu parles de quelles cassettes ?

 

Je me permets de rajouter une question sur ce mécanisme : le promoteur inductible qu'on peut potentiellement mettre c'est celui du gène qu'on veut éliminer ? Et on le place juste avant Cre ?

[carolineb]

@OxyGenS dans mon cours j'ai noté que pour introduire une mutation ciblée il fallait des cassettes de sélection qu'on peut retirer pour ne pas qu'elles aient des effets sur l'expression génique

[OxyGenS]

@carolineb J'ai pas ça (je l'ai peut-être loupé) ce que j'ai par rapport aux cassettes c'est que pour créer la lignée de souris qui ont le gène cible floxé, on le fait par recombinaison homologue et que du coup il y a bcp de proba d'avoir d'autres mutations à cause des cassettes de sélection (mais je t'avoue que c'est pas non plus hyper clair pour moi)

[OxyGenS]

@carolineb En fait tu fais référence aux mutations subtiles plutôt non ?

Dans ce cas-là voici ce que j'ai compris : on veut remplacer un gène par un autre modifié mais qui ne comporte qu'une tte petite modif (mutation ponctuelle - je ne sais pas s'il  n'y a que des mutations ponctuelles ou si ça peut concerner plusieurs bases). Pour isoler le gène à remplacer on utilise des cassettes de sélection. Une fois qu'on a fini, on veut se débarrasser de ces cassettes pcq elles peuvent induire des mutations non désirées; pour cela on utilise le système Cre-lox en floxant les cassettes.

 

J'espère que tu as compris et que mon explication est correcte ( @Ratus ?)

[dupuyadèle]

@carolineb

Salut !

Alors pour commencer par ta question à propos des cassettes : concernant le système CreLoxP, ces cassettes correspondent aux séquences LoxP qui délimitent la partie que tu vas pouvoir éliminer en présence de ta recombinase. Je pense que les cassettes auxquelles toi tu penses sont les cassettes que l'on utilise dans la recombinaison homologue, pour s'assurer que la mutagenèse ait été bien dirigée. Et donc dans le cadre de la recombinaison homologue, on peut laisser en place une cassette dans un exon si on cherche à inactiver un gène, mais si tu veux simplement modifier ce gène en conservant son expression, il faut que tu élimines ta cassette et c'est là que la méthode Cre-LoxP peut t'aider ! 

 

Par rapport à ta question sur les homozygotes, en fait, ça dépend de chaque situation. Mais typiquement, si tu veux étudier les conséquences de la disparition d'une protéine chez un être vivant, il faut que ton inactivation de gène soit double parce que sinon, il te reste un résidu d'expression et tu ne pourras pas voir véritablement l'effet de l'absence de cette protéine d'où la nécessité d'une population homozygote pour cette mutation. 

 

Voilà, dis moi si c'est plus clair pour toi ! 

@OxyGenS

Salut !

 

Pour ta question à propos du promoteur inductible dans le cadre du système Cre-LoxP, l'idée est de le placer devant la recombinase pour pouvoir choisir le tissu ou le moment où elle sera exprimée et où donc elle pourra venir éliminer la séquence du gène floxé. Cela permet de garder une expression de ce gène dans les autres tissus ou à d'autres moments puisque la recombinase n'étant pas exprimée, il n'y aura pas d'élimination de la séquence floxée. 

 

C'est bon pour toi ? 

[OxyGenS]

il y a 9 minutes, dupuyadèle a dit :

Pour ta question à propos du promoteur inductible dans le cadre du système Cre-LoxP, l'idée est de le placer devant la recombinase pour pouvoir choisir le tissu ou le moment où elle sera exprimée et où donc elle pourra venir éliminer la séquence du gène floxé. Cela permet de garder une expression de ce gène dans les autres tissus ou à d'autres moments puisque la recombinase n'étant pas exprimée, il n'y aura pas d'élimination de la séquence floxée. 

Donc on n'est pas obligé d'utiliser un promoteur inductible ? Seulement si on ne l'utilise pas, on ne pourra pas contrôler le moment où on veut activer le recombinase et détruire le gène floxé ?

Et si on utilise un promoteur inductible, on pourra l'activer avec une hormone ou un médicament ? Je comprends moins bien cette partie

[dupuyadèle]

il y a 3 minutes, OxyGenS a dit :

Donc on n'est pas obligé d'utiliser un promoteur inductible ? Seulement si on ne l'utilise pas, on ne pourra pas contrôler le moment où on veut activer le recombinase et détruire le gène floxé ?

Et si on utilise un promoteur inductible, on pourra l'activer avec une hormone ou un médicament ? Je comprends moins bien cette partie

 

C'est exactement ça, le promoteur inductible (ou tissu spécifique selon la situation) te permet à toi en tant qu'experimentateur de choisir le moment précis où sera exprimée ta recombinase et donc éliminée ta séquence floxée. Et pour le stimulus, il peut être très variable : une hormone, un médicament, une molécule x ! 

[OxyGenS]

D'acc merci bcp @dupuyadèle

[carolineb]

@dupuyadèle ok merciii!

Il y a 2 heures, OxyGenS a dit :

ans ce cas-là voici ce que j'ai compris : on veut remplacer un gène par un autre modifié mais qui ne comporte qu'une tte petite modif (mutation ponctuelle - je ne sais pas s'il  n'y a que des mutations ponctuelles ou si ça peut concerner plusieurs bases). Pour isoler le gène à remplacer on utilise des cassettes de sélection. Une fois qu'on a fini, on veut se débarrasser de ces cassettes pcq elles peuvent induire des mutations non désirées; pour cela on utilise le système Cre-lox en floxant les cassette

 et merci à toi aussi @OxyGenS!

[Ratus]

Donc j'arrive après la question @OxyGenS, mais @dupuyadèle a très bien répondu!