QCM Recherche

[OxyGenS]

Bonsoir,

 

J'ai du mal avec les qcm de recherche notamment dans la façon de raisonner... Qqun pourrait me montrer comment procéder par exemple avec le QCM1 du TD svp ?

Quand on nous donne des enzymes de restriction pour l'insert et le plasmide, je comprends pas trop comment on sait si ça peut s'insérer et aussi dans quel sens ou si les 2 sens sont possibles.

 

Merci par avance

[Puromycine]

Salut ^^

 

il y a 3 minutes, OxyGenS a dit :

Qqun pourrait me montrer comment procéder par exemple avec le QCM1 du TD svp ?

J'imagine que tu parles bien du TD du professeur Levade ?

 

Si c'est la cas, je vais tenter de te montré comment j'aurais résolu l'exercice en expliquant point par point : 

 

Vous préparez un cDNA humain par RT-PCR puis, comme il possède deux extrémités EcoRI.

 

Ce que j'ai mis en rouge nous indique que le cDNA possède à son extrémité 5' et 3' un site de coupure pour EcoRI.

Ainsi, il pourra s'insérer dans tout plasmide coupé par une enzyme qui coupe un bord libre identique à EcoRI (J'entends par bord libre ceci : 5'---------G/AATTC------3', en effet, c'est cette partie qui pourra se coller à son complémentaire après digestion du plasmide) ! De plus, comme les deux extrémité ont le même bord libre (car elles sont toutes les deux coupées par EcoRI), le cDNA pourra s'insérer dans les deux sens !

 

Vous l’insérez dans un vecteur plasmidique d’expression préalablement ouvert avec EcoRI.

 

Ceci nous apprends que on aura forcément les même bords libres. En effet, lorsque l'insert et le plasmide sont coupés avec une seule et même enzyme, alors nécessairement l'insert pourra s'intégré dans le plasmide (il n'y a pas forcément la peine de faire un schéma, mais si ça peut te rassurer tu peux en faire un).

 

[Le site EcoRI est par ailleurs absent de la séquence du cDNA et est unique dans le plasmide]

 

Cela nous apprends que la séquence codante ne peut pas être clivée par EcoRI et que le choix de cette enzyme est judicieux.

 

On arrive donc à la problématique et aux questions :

 

A/ à l’insertion du cDNA dans le plasmide avec l’orientation sens

C'est FAUX. En effet, si le cDNA s'était inséré dans l'orientation sens, il aurait pu être transcrit et traduit convenablement. Or, on sait de l'énoncé qu'on n'a obtenu aucune protéine recombinante. L'insert a donc pu s'insérer dans l'orientation non-sens !

 

B/ à l’absence d’insertion du cDNA dans le plasmide, le plasmide digéré par EcoRI s’étant refermé sur lui-même faute d’avoir utilisé la phosphatase alcaline.

C'est VRAI. On ne nous dis pas dans l'énoncé que la phosphatase alcaline a été utilisé, il est donc tout a fait possible (et c'est même une des hypothèse les plus probable) que le plasmide se soit refermé sur lui même, et que l'insert n'est pas pu s'insérer.

 

C/ à une anomalie d’épissage du transcrit synthétisé dans les cellules hôtes (bactéries).

C'est FAUX. On ne trouve pas d'épissage chez les bactéries.

 

D/ à une (ou des) mutation(s) introduite(s) dans le cDNA par la réverse-transcriptase.

C'est VRAI. La reverse transcriptase fait pas mal d'erreurs, il est donc possible qu'il y ait une mutation qui est transformé le codon initiateur ATG en autre chose rendant impossible la traduction de cette protéine dans les bactéries (hypothèse moins probable que la B).

 

E/ au clivage du cDNA par EcoRI.

C'est FAUX. En effet, EcoRI ne coupe pas dans la séquence comme nous l'apprends l'énoncé, mais seulement aux extrémitées.

 

 

il y a 31 minutes, OxyGenS a dit :

Quand on nous donne des enzymes de restriction pour l'insert et le plasmide, je comprends pas trop comment on sait si ça peut s'insérer et aussi dans quel sens ou si les 2 sens sont possibles.

Alors, comme je te l'ai déjà dis plus haut, pour qu'un insert s'insère, il faut que les bords libre soit strictement identique.

 

Une fois que tu as repéré les compatibilité d'enzyme, il faut que tu repères le sens dans lequel ça peut s'insérer. Par exemple, si dans l'insert tu as une séquence qui fait :

5'--EcoRI----partie-codante-----XhoI--3' et que dans le plasmide on a 5'--XhoI-----EcoRI-3' l'insert s'insérera en antisens et ne pourras pas être transcrit. (NB: EcoRI pourrait être remplacé par toute enzyme qui coupe 5'-X/AATTCY-3' et vice versa pour XhoI).

 

Là où ça peut s'insérer dans les deux sens, c'est lorsque l'insert et le plasmide vont être digéré avec des enzymes qui proposent les mêmes bords libres (strictement les mêmes, j'insiste !). Par exemple : XhoI 5'...C/TCGAG...3' et SalI 5'...G/TCGAC...3'.

A chaque fois qu'un insert est digéré par deux enzymes donc le bord libre est identique, alors, il pourra s'insérer dans les deux sens -maintenant, il faut que la partie codante soit intégrée aussi, donc les enzymes doivent couper de part et d'autre de cette partie-.

 

 

Voilà

 

Je ne sais pas si j'ai été des plus clair, donc n'hésite surtout pas à me relancer si tu as un seul doute ! ^^

 

En attendant, bon courage pour la suite

 

[OxyGenS]

Salut @Puromycine merci bcp d'avoir pris du tps pour me répondre, les choses sont déjà plus claires !

Il me reste des incompréhensions (tjs avec moi^^) :

 

Il y a 10 heures, Puromycine a dit :

5'---------G/AATTC------3'

On se fiche du C ici ? Ou à chaque fois il faut bien faire attention à toutes les bases présentes sur le site de restriction ?

 

Il y a 10 heures, Puromycine a dit :

[Le site EcoRI est par ailleurs absent de la séquence du cDNA et est unique dans le plasmide]

 

Cela nous apprends que la séquence codante ne peut pas être clivée par EcoRI et que le choix de cette enzyme est judicieux.

S'il avait été présent, ça aurait pu être la cause (probable ou obligatoire ?) de l'absence de protéine recombinante ?

 

Il y a 10 heures, Puromycine a dit :

A/ à l’insertion du cDNA dans le plasmide avec l’orientation sens

C'est FAUX. En effet, si le cDNA s'était inséré dans l'orientation sens, il aurait pu être transcrit et traduit convenablement. Or, on sait de l'énoncé qu'on n'a obtenu aucune protéine recombinante. L'insert a donc pu s'insérer dans l'orientation non-sens !

Est-ce que tu pourrais me faire un rappel/m'expliquer les insertions sens/non-sens stp ?

 

Il y a 10 heures, Puromycine a dit :

C/ à une anomalie d’épissage du transcrit synthétisé dans les cellules hôtes (bactéries).

C'est FAUX. On ne trouve pas d'épissage chez les bactéries.

 

D/ à une (ou des) mutation(s) introduite(s) dans le cDNA par la réverse-transcriptase.

C'est VRAI. La reverse transcriptase fait pas mal d'erreurs, il est donc possible qu'il y ait une mutation qui est transformé le codon initiateur ATG en autre chose rendant impossible la traduction de cette protéine dans les bactéries (hypothèse moins probable que la B).

Est-ce que ça te dérangerait de faire un petit récap de tous les trucs de ce genre à savoir pour les qcm stp ? (j'espère que tu vois ce que je veux dire)

 

Il y a 10 heures, Puromycine a dit :

5'--EcoRI----partie-codante-----XhoI--3' et que dans le plasmide on a 5'--XhoI-----EcoRI-3' l'insert s'insérera en antisens et ne pourras pas être transcrit.

Là, dsl j'ai pas compris

 

Il y a 10 heures, Puromycine a dit :

maintenant, il faut que la partie codante soit intégrée aussi, donc les enzymes doivent couper de part et d'autre de cette partie-.

Cette info sera donnée dans l'énoncé ?

[Puromycine]

Bah de rien ^^

 

Il y a 2 heures, OxyGenS a dit :

On se fiche du C ici ? Ou à chaque fois il faut bien faire attention à toutes les bases présentes sur le site de restriction ?

En effet, on s'en fiche, et il ne faut regarder QUE les bords libre. Ici, le C sera en face d'un G (donc pas libre), car il ne faut pas oublier que les Enzymes de restriction coupent un ADN double brin !

 

 

Il y a 2 heures, OxyGenS a dit :

S'il avait été présent, ça aurait pu être la cause (probable ou obligatoire ?) de l'absence de protéine recombinante ?

Tout à fait, lorsque l'on coupe la séquence codante en 2, alors, on n'aura pas la protéine (c'est comme un très grosse délétion...)

 

Il y a 2 heures, OxyGenS a dit :

Est-ce que tu pourrais me faire un rappel/m'expliquer les insertions sens/non-sens stp ?

Une insertion sens, c'est lorsque le brin codant s'insère dans le brin codant du plasmide, il pourra donc être traduit (rappel, le brin codant est aussi appelé brin sens).

Une insertion non sens voit la séquence codante (ou sens) de l'insert s'insérer au niveau du brin non sens (ou non codant) du plasmide (rappel, le sens 5'-3' soit être respecté).

 

 

Prenons cet exemple tout à fait fictif. J'ai mis de la même couleur les enzymes dont le bord libre est strictement identique.

Le cDNA 1 va s'insérer "sens". En effet, tu peux remarquer que les bords libres "rouges" et "bleus" sont dans le même sens quant à la transcription.

Le cDNA 2 va s'insérer "non-sens". En effet, tu peux remarquer que les bords libre sont inversé. C'est "comme si" on avait le codon stop avant le codon initiateur -dans la réalité, comme dis ci dessus, c'est le brin non codant de l'insert qui se et au milieu du brin codant. (fais toi un schéma, tu verra c'est assez clair ^^).

Le cDNA 3 pourra s'insérer dans les deux sens (si le plasmide n'est digéré qu'avec Enz1), car les deux sens sont possible !

 

Il y a 2 heures, OxyGenS a dit :

Est-ce que ça te dérangerait de faire un petit récap de tous les trucs de ce genre à savoir pour les qcm stp ? (j'espère que tu vois ce que je veux dire)

 

Je vais essayer de rien omettre (mais globalement ce sont les cours de génomes) :

- il faut se rappeler que les procaryotes -donc les bactéries- n'ont pas l'épissage, contrairement aux eucaryotes. C'est d'ailleur pour cette raison que l'on utilise le cDNA qui, par définition, n'a pas d'introns.

- Les Sangers (j'en ai vu un lors du TD) : se rappeler qu'il faut lire à l'envers du sens de migration (donc de bas en haut !)

- Southern/Northern Blot, PCR et Electrophorèse. Pour les Blots, il faut une sonde (cette dernière ne sera pas montrée dans les QCM de recherche, en théorie). Le Southern Blot analyse l'ADN (y compris le cDNA), et le Northern Blot analyse l'ARN. La PCR et l'electrophorèse ne nécessitent pas de sondes. Attention, en PCR, en cas de digestion avec les enzymes de restriction, il n'y aura pas d'amplification !

- Les isoschizomères coupent la séquence reconnues de la même manière. (ATTENTION ! On ne regarde, dans ce cas, pas que le bords libre, mais toute la séquence ! C'est un piège récurent en recherche !!!)

 

 

Il y a 3 heures, OxyGenS a dit :

Cette info sera donnée dans l'énoncé ?

Cette info sera toujours donné dans l'énoncé. Les exercices classiques sont des exercices où il faut choisir les enzymes et dire qu'est-ce qu'il se passera. Tu auras donc des schéma comme ce que j'ai donné en Annexe 2 avec plus d'enzymes de restriction ! Si une enzyme est situé, pour l'insert, entre le ATG et le codon STOP, alors, il ne faut PAS digérer l'insert avec cette enzyme, sous peine de perdre l'expression du gène !

 

 

J'espère que c'est plus clair ! Toujours pareil, si tu as encore des question, c'est de ma faute, donc hésite pas à me relancer

 

Bon courage !

[OxyGenS]

il y a 14 minutes, Puromycine a dit :

Tout à fait, lorsque l'on coupe la séquence codante en 2, alors, on n'aura pas la protéine (c'est comme un très grosse délétion...)

Est-ce que si le site est présent dans la séquence, c'est forcément dans la séquence codante et donc ça empêche forcément d'avoir la protéine ou ça peut être en dehors de la séquence codant pour la protéine mais quand même dans l'insert ? (j'espère que c'est à peu près compréhensible)

 

il y a 14 minutes, Puromycine a dit :

Le cDNA 3 pourra s'insérer dans les deux sens (si le plasmide n'est digéré qu'avec Enz1), car les deux sens sont possible !

S'il est digéré avec les 2 ce n'est pas possible ? D'ailleurs quand un plasmide est digéré par 2 enzymes, ça enlève un fragment carrément ? (je pose peut-être des questions débiles mais je suis pas encore à l'aise avec tt ça)

 

il y a 19 minutes, Puromycine a dit :

Toujours pareil, si tu as encore des question, c'est de ma faute, donc hésite pas à me relancer

C'est plutôt de la mienne qd même haha.

 

Je vais essayer moi aussi de digérer ttes ces infos (lol) et de faire des qcm pour voir si ça va mieux et si j'ai tjs des pb je reviens vers toi alors. Merci bcp !

[Puromycine]

il y a 47 minutes, OxyGenS a dit :

Est-ce que si le site est présent dans la séquence, c'est forcément dans la séquence codante et donc ça empêche forcément d'avoir la protéine ou ça peut être en dehors de la séquence codant pour la protéine mais quand même dans l'insert ? (j'espère que c'est à peu près compréhensible)

Non, il faut forcément que ce soit avant le ATG et après le codon stop, car ne sera inséré dans le plasmide que la partie situé entre les deux site digérés ! ^^

 

il y a 49 minutes, OxyGenS a dit :

S'il est digéré avec les 2 ce n'est pas possible ? D'ailleurs quand un plasmide est digéré par 2 enzymes, ça enlève un fragment carrément ?

En effet, un fragment entier s’enlèvera, on aura donc lus qu'un site d'insertion pour rouge et un site pour bleu. Attention, pour les plasmide, lorsqu'on a deux sites avec des bords libres strictement identique (comme ici avec que du rouge), il faut la phosphatase alcaline !!!!

 

Voilà ^^

 

J'espère avoir pu t'éclairer ^^

[OxyGenS]

@Puromycine

Dsl je me rends compte que je ne t'ai jamais répondu au dernier msg.

Merci bcp pour tes explications qui m'ont bien aidées