phosphatase alcaline

[carolineb]

Bonsoir, je ne comprends pas trop comment fonctionne la phosphatase alcaline, elle retire les groupements phosphates en 3' et 5' mais au final en quoi ça empêche le vecteur de se refermer sur lui même? 

merci d'avance!

[HECATE]

Saluuut enfait si je ne me trompe pas, ton vecteur est lié par des liaisons phosphodiesters donc si tu coupes avec ton enzyme de restriction et que tu appliques de la phosphatase alcaline tu retires le phosphate du lieu de coupure. Vu que tu le retires, le vecteur ne peut plus refaire sa liaison (il manque un phosphate) et par conséquent il ne peut pas se refermer sur lui même

[carolineb]

@HÉCATE mais du coup comment l'insert peut s'introduire dans le vecteur après?

 

[Metallica]

@carolineb Quand on mettra l'insert en présence du plasmide , on ajoutera également une ADN ligase ainsi que son substrat à savoir des phosphates ce qui permettra de recréer des liaisons phosphodiesters permettant à l'insert de s'intégrer dans le plasmide 

[Please]

@Metallica Coucou ^^ est-ce que la phosphatase alcaline est toujours nécessaire ? Et si oui, si Levade ne le précise pas dans les énoncés on doit le prendre en compte ?

Mercii

[Chat_du_Cheshire]

il y a 3 minutes, Please a dit :

@Metallica Coucou ^^ est-ce que la phosphatase alcaline est toujours nécessaire ? Et si oui, si Levade ne le précise pas dans les énoncés on doit le prendre en compte ?

Mercii

non il ne le dit pas forcément, exemple ici

 

[Please]

@Chat_du_Cheshire désolé mais j'ai du mal à saisir (je devrais dormir plus mdrr) En annale, s'il ne le précise pas, on fait comme si la PA à été employée ou non ? ^^

[Chat_du_Cheshire]

à l’instant, Please a dit :

@Chat_du_Cheshire désolé mais j'ai du mal à saisir (je devrais dormir plus mdrr) En annale, s'il ne le précise pas, on fait comme si la PA à été employée ou non ? ^^

pour moi non, comme le montre ce QCM. D'ailleurs j'ai retrouvé la réponse de Levade au sujet de cet item :

 

Citation

Question :

Bonjour Monsieur, 

J'ai une petite question  à propos de l'item B du QCM 16 du concours 2015 de Recherche.

Je n'arrive pas à comprendre pourquoi l'item B est compté Vrai. Selon moi, le plasmide pourrait se refermer sur lui même par ces deux enzymes ( qui génèrent des bouts cohésifs ) car il n'est pas précisé l'utilisation d'une phosphatase alcaline ou bien une indication comme  " dans des conditions idéales" qui enlèverait le Phosphate en 5' et ainsi empêcherait que le plasmide se refèrme sur lui même ( car il n'y a plus que des OH libres) .

Pouvez-vous m'indiquer mon erreur de raisonnement ? 

Citation

Réponse :

Quand le plasmide aura été digéré par SfcI et PstI, les extrémités du vecteur ne pourront pas se lier car elles ne sont pas "compatibles" (voyez comment elles sont protrusives).

 

[Please]

@Chat_du_Cheshire parfait merci BEAUCOUP

[Chat_du_Cheshire]

pas de soucis