Sens insertion enzyme

[liil]

Salut !!

Je ne comprends pas bien comment on fait pour savoir si on peut insérer dans 1 ou 2 sens, qu'est-ce qu'il faut regarder sur les enzymes qu'on nous propose ?

Par exemple, dans le QCM 8 les items B, C et D ?

 

 

[Metallica]

Coucou @liil

 

 

Le 21/02/2020 à 19:56, liil a dit :

Salut !!

Je ne comprends pas bien comment on fait pour savoir si on peut insérer dans 1 ou 2 sens, qu'est-ce qu'il faut regarder sur les enzymes qu'on nous propose ?

Par exemple, dans le QCM 8 les items B, C et D ?

 

B est fausse et C et D sont justes ?

 

Du coup oui il faut regarder les enzymes qu'on nous propose , prenons l'item C :

 

Pour savoir si l'insert s'insère dans les deux sens , il faut respectivement savoir si les associations des bouts générés par les deux paires d'enzymes restrictives  SunI/Acc651 et Pae1/Pae1 d'un coté et les deux paires SunI/Pae1 et Acc651/Pae1 d'un autre coté sont compatibles.

 

Pour les deux premières paires , ben Pae1/Pae1 ça sera compatible ( logique x) ) et pour SunI/Acc651 on va se retrouver avec ça :

 

SunI --->    (3') GCATGG (5') <---- Acc651

                    (5') CGTACC (3')

 

Du coup tu peux bien voir que c'est compatible

 

Ce que je viens de faire permet de s'assurer que c'est le cas mais il y a une méthode beaucoup plus rapide pour savoir si deux enzymes restrictives vont générer des bouts compatibles ou non.

 

On va reprendre SunI et Acc65.  SunI: C/GTACG et Acc651: G/GTACC. On sait que la particularité des sites reconnus par les enzymes de restriction est son caractère palindromique.

 

Pour SunI on coupe après le C donc par complémentarité le G au bout de la séquence lui sera forcément associé on se retrouve donc avec ce motif (5')GATC(3') qui sera associé à un autre motif.

Pareil pour Acc651  on coupe après le G donc on retire le dernier C et on se retrouve avec le motif (5')GTAC(3').

 

On obtient finalement deux motifs GTAC associables à un autre après actions de ces enzymes et sachant que les brins se feront faces , il va y avoir inversion de l'un des deux motifs et ça va coller ---> (5') GTAC (3')

                                             (3') CATG (5')

 

Dernière étape qui est très importante , c'est de vérifier si les 2 ER coupent au même endroit (avant ou après le motif central). Si les deux coupent avant/après le motif central alors les sites seront compatibles (à condition que les étapes précédentes soient respectées bien sur) mais par contre si l'une coupe avant et l'autre après ça ne sera pas compatible

 

En résumé ,

 

Tu appliques les mêmes étapes pour les deux sites visés par les enzymes de restrictions qui te sont proposées: 

 

1) Tu regardes les bases qu'il y a avant (ou après tout dépend  ..faut prendre la partie ou il y a le moins de bases) la coupure générée par l'enzyme

2) Tu écartes ensuite les bases "miroirs" s'associant aux bases qui se situent avant (ou après) la coupure

3) Tu obtiens en appliquant cette méthode sur les 2 sites, deux motifs centraux que tu compareras en faisant attention à les orienter tout deux en 5'--->3' .

4) Si les motifs centraux  obtenus ( après les étapes 1) et 2) ) sont strictement identiques alors les bouts générés seront compatibles , s'ils sont différents alors ils ne le seront pas.

5) Vérifier que les ER coupent "au même endroit "

 

Avec un peu d'entrainement ça te permettra d'aller bien plus vite par rapport à qqln qui fera le même type de schéma que moi au dessus.

 

Du coup on reprend l'item C

 

On sait déjà que les bouts générés par les deux paires d'enzymes restrictives  SunI/Acc651 et Pae1/Pae1 sont compatibles ce qui signifie que l'insert peut s'insérer au moins dans un sens , reste maintenant à savoir s'il peut s'insérer dans l'autre. On va donc procéder aux mêmes étapes mais avec les 2 paires de sites générés par les deux paires d'enzymes restrictives 

SunI/Pae1 et Acc651/Pae1.

 

On va utiliser la technique dont je t'ai parlé juste avant pour SunI/Pae1

 

SunI :  (5') C/GTACG (3') ---> (5')GTAC(3')

Pae1:  (5') GCATG/C (3') --->  (5') CATG(3')

 

Orientées en 5'-->3' les séquences centrales obtenues ne sont pas les mêmes ce qui veut dire que l'insert ne pourra pas s'insérer dans ce sens ..on a  même pas besoin de vérifier pour l'autre paire parce que de 1) Vu que ça ne marche pas ici ça ne marchera pas tout court peu importe que ça marche pour l'autre paire de sites et 2) ça ne pourra logiquement pas marcher dans le cas présent puisqu'on sait SunI et Acc651 sont compatibles donc si SunI n'est pas compatible avec Pae1 forcément Acc651 ne le sera pas elle aussi.

 

Donc , cet insert s'inserera dans un seul sens d'ou la B fausse et la C vraie.

 

item D, c'est la même chose :

 

Pour NcoI/ FatI , on a un motif central (5')CATG(3') commun aux deux sites générés par ces enzymes de restrictions donc ça sera compatible à ce niveau.

ça sera également le cas pour SunI/Acc651 (on l'a démontré dans l'item C)..il peut donc déjà s'insérer dans un sens.

 

Maintenant observons les possibilités d'associations vis-à-vis des sites crées à partir de la paire d'enzymes FatI/Acc651 ( j'ai choisi cette paire là mais ça aurait pu tout aussi bien être la paire SunI/NcoI ou encore NcoI/Acc651).

 

FatI: (5') /CATG (3') ---> (5') CATG (3')

Acc651 : (5') G/GTACC (3') ---> (5') GTAC (3')

 

On remarque là encore que les motifs centraux ne sont pas indentiques quand ils sont tous les deux orientés en 5'---> 3' donc l'insert ne pourra pas s'insérer dans ce sens là

 

Vu qu'il ne peut s'insérer que dans un seul sens , l'item D est logiquement vrai

les ER ne libèrent pas l'insert

 

Voilà j'espère que ça va t'aider

 

 

 

 

Edited February 27, 2020 by Metallica

[liil]

Merciiiii bcp de tous ces détails @Metallica

J'ai totalement compris

Par contre j'ai une dernière question , pour utiliser la technique rapide, ça veut dire qu'on doit tjrs vérifier que les bases "miroirs" sont complémentaires ? genre si c'est pas le cas les enzymes sont pas compatibles du coup ?

 

Effectivement la B est fausse et la C est vraie, par contre la D est fausse mais pas pour une raison de sens juste parce que ce sera pas la totalité de l'insert avec le gène d'intérêt qui sera intégré et ça se voit quand on regarde l'emplacement des sites de restrictions sur le schéma. Donc bref t'as quand même raison pour le sens.

 

 

Edited February 23, 2020 by liil

[Metallica]

il y a 24 minutes, liil a dit :

Merciiiii bcp de tous ces détails @Metallica

J'ai totalement compris

Par contre j'ai une dernière question , pour utiliser la technique rapide, ça veut dire qu'on doit tjrs vérifier que les bases "miroirs" sont complémentaires ? genre si c'est pas le cas les enzymes sont pas compatibles du coup ?

 

Elles le seront toujours puisque les enzymes de restriction reconnaissent des séquences doubles brins palindromiques 

 

il y a 25 minutes, liil a dit :

Effectivement la B est fausse et la C est vraie, par contre la D est fausse mais pas pour une raison de sens juste parce que ce sera pas la totalité de l'insert avec le gène d'intérêt qui sera intégré et ça se voit quand on regarde l'emplacement des sites de restrictions sur le schéma. Donc bref t'as quand même raison pour le sens.

 

Oui ptn oui j'avais pas fait gaffe que ces 2 enzymes ne libéraient pas du tout l insert

[XinSki14]

Bonjour, je viens de lire cette discussion car j'ai rencontré le meme problème. Mais j'ai une question, comment fait-on pour savoir dans quel sens l'énoncé nous donne l'enzyme de restriction? vu qu'il faut toujours comparer les séquences en (5') ... (3'), quand est ce qu'elles sont présentées en 3' ... 5' ? 

Merci d'avance et merci pour cette explication qui m'a permis de comprendre la méthode.  

[Metallica]

il y a 15 minutes, alex07 a dit :

Bonjour, je viens de lire cette discussion car j'ai rencontré le meme problème. Mais j'ai une question, comment fait-on pour savoir dans quel sens l'énoncé nous donne l'enzyme de restriction? vu qu'il faut toujours comparer les séquences en (5') ... (3'), quand est ce qu'elles sont présentées en 3' ... 5' ? 

Merci d'avance et merci pour cette explication qui m'a permis de comprendre la méthode.  

 

Coucou , faut pas forcément que ça soit en 5' -->3' , il faut juste que lors de la comparaison il y ait la même orientation des sites. Sinon j'ai dit qu'il fallait faire attention à l'orientation au cas ou il viendrait à l'esprit du Pr.Levade d'indiquer les orientations des sites et d'en inverser certains ( ce qui pourrait induire en erreur) mais généralement les extrémités ne sont pas citées ce qui veut dire que tous les sites sont orientés de la même manière :))

Edited February 27, 2020 by Metallica

[carolineb]

Le 22/02/2020 à 01:19, Metallica a dit :

 

SunI --->    (3') GCATGG (5') <---- Acc651

                    (5') CGTACC (3')

 

salut @Metallica! ici je ne comprends pas trop sachant que Sun coupe C/GTACG pourquoi le GTACG est orienté en 3' --> 5'?

[Metallica]

Il y a 2 heures, carolineb a dit :

ici je ne comprends pas trop sachant que Sun coupe C/GTACG pourquoi le GTACG est orienté en 3' --> 5'?

 

Il est pourtant bien orienté en 5'--->3' sur cette construction

[carolineb]

@Metallica ah oui je voulais dire GCATG désolé!

 

en fait je comprends pas comment on peut savoir dans quel sens on s'y prend pour savoir si c'est compatible ou pas..

[Luciolette]

Coucou @carolineb !

En fait il faut que d'une part tu regardes ton cDNA qui est orienté en 5'->3' et sur lequel on te donne différents site de restriction. D'un autre côté, on te donne le vecteur avec ses différents sites de restriction qui lui aussi est une orientation.

Ainsi en comparant si les enzymes sont compatibles tu vas pouvoir déterminer le sens d'insertion. Pour savoir si deux enzymes sont compatibles il faut regarder si ce qui va se "recoller" est bien complémentaire. Pour cela il suffit que la séquence en 5'->3' soit identique.

Par exemple : SunI C/GTACG  et Acc651 G/GTACC  (en fait ici on te met une "barre" après la première lettre donc dans ta tête tu peux mettre une barre en symétrie de la première, soit ici avant la dernière lettre puis on compare ce qu'il y a entre les deux barres.)

Ici on remarque que l'on retrouve la même séquence, donc ces deux enzymes sont compatibles.

Puis comme ils l'ont expliqué plus haut, tu peux déterminer l'ordre d'insertion grâce au complémentarité des enzymes.

 

Es-ce que c'est clair ?

N'hésite pas si tu as d'autres questions, bon courage !

 

[carolineb]

@Luciolette ok j'ai compris merci bcp! et ça marche à tous les coups de faire comme ça?

[Reïner]

Salut @carolineb

 

Il y a 14 heures, carolineb a dit :

ok j'ai compris merci bcp! et ça marche à tous les coups de faire comme ça?

 

ça va marcher à chaque fois à condition de respecter ça :

 

Le 22/02/2020 à 01:19, Metallica a dit :

Dernière étape qui est très importante , c'est de vérifier si les 2 ER coupent au même endroit (avant ou après le motif central). Si les deux coupent avant/après le motif central alors les sites seront compatibles (à condition que les étapes précédentes soient respectées bien sur) mais par contre si l'une coupe avant et l'autre après ça ne sera pas compatible

 

Je te prends un exemple :

 

A : 5' C/CATGG 3'

B : 5' G/CATGC 3'

C : 5' CCATG/G 3'

D : 5' GCATG/C 3'

 

Ici les sites crées par ces 4 enzymes présentent le même segment 5'CATG3' pourtant tout ces sites ne sont pas compatibles entre eux. Les seules combinaisons possibles seront A/B et C/D les autres ne fonctionneront pas (tu peux vérifier par toi même en faisant les constructions correspondant à chaque combinaison). 

 

C'est très important de vérifier ça autrement tu as une chance sur deux de te planter

 

Edited March 7, 2020 by Reïner

[carolineb]

@Reïner ah oui c'est vrai! merci beaucoup c'est très clair!