Chromato d'affinité

[Antoinee]

Bonjour ! J'ai un peu de mal avec ce genre de graphiques, genre en abscisse le principe de volume élué m'échappe, je sais pas trop à quoi ça correspond, et comment faire si on tombe face à ce type de graphique en QCM ?

 

 

[LdvMstr]

Coucou,

 

Pour la chromatographie d'affinité, le but est de purifier une protéine en utilisant son affinité pour un ligand. D'autres part, l'élution en fait c'est une processus au cours duquel les molécules n'interagissant pas avec la phase stationnaire ( = support solide, colonne) sortent de la colonne. Ainsi le volume élué (Ve), c'est le volume de protéine qui ne se fixe pas sur la colonne, donc ne présentant pas d'affinité pour la phase stationnaire. 

 

Exemple : on souhaite purifier la GST.

1. Tout d'abord, pour purifier la GST on utilise la GSH (car cette protéine présente une forte affinité pour la GST) couplée à des billes de sépharose, le tout formant un support solide = phase stationnaire.
2. Ensuite, on prend un extrait protéique brut, dans lequel est présent notre protéine d'intérêt, ici la GST = phase mobile.

Donc, dans un premier temps, lorsqu'on ajoute notre phase mobile, toutes les protéines qui n'ont pas d'affinité pour la GSH ne vont pas se fixer sur la colonne, donc elle vont être élué = non retenues. Ainsi on observera un premier pic d'absorbance à 280 nM, avec une bande large.

Puis, pour détacher la protéine retenue, que l'on souhaite purifié, on ajoute de la GSH en excès, ainsi la GSH en excès entre en compétition avec la GSH de la colonne (phase stationnaire), permettant ainsi d'élué la protéine GST, et ainsi de récupérer la GST sous forme purifiée. On obtient alors un deuxième pic, qui correspond à la protéine éluée.

 

Voilà j'espère que c'est clair et que j'ai répondu à tes questions. 

Edited February 18, 2020 by LdvMstr

[Antoinee]

C'est bon pour moi, merci !