maestro Posted February 6, 2020 Posted February 6, 2020 Bonsoir! lorsqu’on integre un insert à un plasmide, ocmment on sait si il peut s’insérer dans un ou les deux sens? pourquoi ici dans la diapo du prof il y a écrit que la selection negative par HSV TK donne résistance au gancyclovir? c’est pas plutot une sensibilité? ou il voulait dire qu’on selecttionne par HSV tk les cell qui sont resistantes au gancyclovir? Merci d'avance♡ Quote
Porthos Posted February 7, 2020 Posted February 7, 2020 Salut ! Il y a 15 heures, maestrokimpembe a dit : lorsqu’on integre un insert à un plasmide, ocmment on sait si il peut s’insérer dans un ou les deux sens? En fait, tout dépend des enzymes de restrictions qu'on te donne pour résoudre l'exercice. Quand tu vérifies que ton insert rentre dans le plasmide, tu regardes au passage sintu peux "retourner l'insert" et le faire rentrer en mettant la partie 3' en 5' et voir si les deux bouts sont collants (A en face de T et C en face de G quoi). Il y a 15 heures, maestrokimpembe a dit : pourquoi ici dans la diapo du prof il y a écrit que la selection negative par HSV TK donne résistance au gancyclovir? c’est pas plutot une sensibilité? ou il voulait dire qu’on selecttionne par HSV tk les cell qui sont resistantes au gancyclovir? En fait la cassette TK rend les cellules sensibles au gancyclovir. Donc si la cassette est transcrite, ça veut dire que l'insertion s'est mal faite et donc en ajoutant le gancyclovir au milieu on va éliminer ces cellules. Du coup on parle de selection négative car quand l'insertion est mal faite, ça tue. Au contraire lors d'une sélection positive, si c'est bien fait, ça fait survivre. Dans la diapo je pense que par "résistance au gancyclovir", il insinue que si l'insertion s'est bien faite, alors la cellule survie (car la cassette TK n'est pas transcrite ) Bonne journée ! Quote
maestro Posted February 7, 2020 Author Posted February 7, 2020 il y a 44 minutes, Porthos a dit : En fait la cassette TK rend les cellules sensibles au gancyclovir. Donc si la cassette est transcrite, ça veut dire que l'insertion s'est mal faite et donc en ajoutant le gancyclovir au milieu on va éliminer ces cellules. Du coup on parle de selection négative car quand l'insertion est mal faite, ça tue. Au contraire lors d'une sélection positive, si c'est bien fait, ça fait survivre. Dans la diapo je pense que par "résistance au gancyclovir", il insinue que si l'insertion s'est bien faite, alors la cellule survie (car la cassette TK n'est pas transcrite Super merci! il y a 44 minutes, Porthos a dit : En fait, tout dépend des enzymes de restrictions qu'on te donne pour résoudre l'exercice. Quand tu vérifies que ton insert rentre dans le plasmide, tu regardes au passage sintu peux "retourner l'insert" et le faire rentrer en mettant la partie 3' en 5' et voir si les deux bouts sont collants (A en face de T et C en face de G quoi). d'accord! et pour des bouts droits/francs, c'est tjrs insérable dans les deux sens? Quote
Ancien Responsable Matière Ratus Posted February 9, 2020 Ancien Responsable Matière Posted February 9, 2020 Le 07/02/2020 à 14:05, maestrokimpembe a dit : d'accord! et pour des bouts droits/francs, c'est tjrs insérable dans les deux sens? Non, pas nécessairement, car ça dépend de si tu as coupé à un ou deux endroits! De plus, (mais là c'est à prendre avec des pincettes il faut que je vérifie @Théophylline) il me semble que les bouts francs ne permettent pas l'insertion car se referme directement. Quote
maestro Posted February 9, 2020 Author Posted February 9, 2020 Salut @Ratus Dans cette diapo le prof précise bien "bouts francs ou cohésifs" J'avais posé la question par rapport à ce qcm du poly du tat, Révélation QCM V8 : CE A. L'insertion n'est pas possible en utilisant ces enzymes de restriction. B et C. L'insertion ne peut se faire que dans un seul sens avec ces enzymes de restriction. D. Seule la partie de l'insert comprise entre les deux sites de coupure sera insérée dans le plasmide et non pas la totalité. Le gène d'intérêt ne sera alors pas présent dans le vecteur recombinant. Comment tu ( @Porthos) procèdes pour voir que l'insert digéré par Acc651 et Pae1 pourra s'insérer dans un seul sens dans le vecteur par Sun1 et Pae1? Acc651: G/GTACC. SunI: C/GTACG Le 07/02/2020 à 13:19, Porthos a dit : tu regardes au passage sintu peux "retourner l'insert" et le faire rentrer en mettant la partie 3' en 5' et voir si les deux bouts sont collants (A en face de T et C en face de G quoi). j'ai un peu du mal avec ton explication, est-ce que tu pourrais me montrer concretement comment tu fais stp? Merci d'avance Quote
Ancien Responsable Matière Ratus Posted February 9, 2020 Ancien Responsable Matière Posted February 9, 2020 Il y a 3 heures, maestro a dit : Dans cette diapo le prof précise bien "bouts francs ou cohésifs" Ok, ça marche pour les deux alors! Il y a 3 heures, maestro a dit : j'ai un peu du mal avec ton explication, est-ce que tu pourrais me montrer concretement comment tu fais stp? Là pour le coup je lui pardonne c'est un peu compliquer à expliquer par ordinateur. As-tu fais les TD à ce propos? Si oui ça sera un peu plus simple à expliquer! Si non le plus simple est que tu viennes nous voir en perm, car c'est beaucoup plus simple d'expliquer ça en direct. Quote
Ancien Responsable Matière Théophylline Posted February 9, 2020 Ancien Responsable Matière Posted February 9, 2020 Salut !! Il y a 3 heures, Ratus a dit : Non, pas nécessairement, car ça dépend de si tu as coupé à un ou deux endroits! De plus, (mais là c'est à prendre avec des pincettes il faut que je vérifie @Théophylline) il me semble que les bouts francs ne permettent pas l'insertion car se referme directement Je pense que si tu traites l'ADN, ça ne se refermera pas, et normalement tu devrais pouvoir y coller ce que tu veux et comme tu veux puisque l'on n'a plus à se soucier des bases (du coup il faut que le vecteur ait des bouts francs aussi). Mais j'ai pas le souvenir d'avoir vu ça en QCM... Il me semble qu'il nous a déjà donné des bouts francs + bouts cohésifs et il demandait si c'était possible de les coller et du coup c'était non (je crois que c'est dans les qcm d'entrainement ou de td). J'espère que ça t'aide ! Et t'inquiète pas, avec l'entraînement ça devient presque automatique Quote
Solution LanaBanana Posted February 9, 2020 Solution Posted February 9, 2020 Salut @maestro ! Je vais t'expliquer en prenant d'abord un item vrai, pour pouvoir bien comprendre, donc prenons l'item C ! On te dit qu'on va récupérer un morceau d'insert grâce aux enzymes Acc651 et PaeI. D'abord regarder si ces enzymes agissent sur l'insert ! Ca parait bête dit comme ça mais ce genre de piège existe dans les QCMs. Ici, on voit que ces 2 enzymes agissent sur l'insert donc c'est bon. Si on avait dit qu'on utilisé l'enzyme SunI sur l'insert, l'item aurait été immédiatement faux car cette enzyme n'agit pas dessus. Il faut également faire attention à ce que les enzymes ne coupent pas en plein milieu de la partie de l'insert que tu souhaite récupérer. C'est pas le cas ici, mais imaginons qu'une enzyme coupe entre le codon E1 et le codon E2, tu ne pourras pas avoir l'insert voulu en entier, donc l'item est faux. Ici, tout est correct donc on continue. On te donne les sites de coupures des enzymes donc notes les en entier côte à côte. Imagine que ton insert est une grande corde dont tu veux récupérer un morceau au centre ; les sites de coupures des enzymes seront alors les endroits où tu couperas ta corde avec tes ciseaux. Donc tu as : GGTACC (bout d'insert / ou bout de corde) GCATGC (Acc651) (PaeI) Pour que tu puisses bien comprendre, note ensuite les nucléotides correspondant en face. (Une fois bien entraîné tu n'auras pas besoin de cette étape). GGTACC (bout d'insert / ou bout de corde) GCATGC CCATGG CGTACG Maintenant, note les endroits où coupe l'enzyme (représentés par des barres) : G/GTACC (bout d'insert / ou bout de corde) GCATG/C CCATG/G C/GTACG Une fois coupé, tu te débarrasse des bouts d'insert qui ne te servent à rien (en gros les morceaux qui sont vers l'extérieurs) et tu garde celui qui est un milieu. Tu te retrouves donc avec ça : (avec l'habitude tu arriveras à faire cette étape directement) /GTACC (bout d'insert / ou bout de corde) GCATG/ /G C Passons maintenant au vecteur, il est digéré par SunI et PaeI Comme tout à l'heure on vérifie bien que ces enzymes agissent sur le vecteur. On regarde sur le schéma, c'est bien le cas donc on continue. Et on va faire les mêmes étapes (je vais pas autant détailler) : C/GTACG (bout de vecteur) GCATG/C GCATG/C C/GTACG La seule différence c'est qu'ici tu vas garder les bouts qui sont à l'extérieur et jeter celui qui est à l'intérieur : visualise ton vecteur sous forme de cercle , tu veux remplacer un petit morceau par ton insert donc tu te débarrasse de ce morceau et tu garde le reste du cercle. Du coup il nous reste : (reste du vecteur) C/ /C (reste du vecteur) GCATG/ /GTACG A priori, on se retrouverai avec ce genre de formes (avec l'insert en bleu et le vecteur en vert). Elles ont l'air de pouvoir s'emboîter donc c'est bien ! Mais attention il reste à voir si les nucléotides sont complémentaires ! Pour ça il ne te reste qu'à combiner les deux bouts et voir si ça match : CGTACC GCATGC GCATGG CGTACG (J'ai souligné l'insert pour que tu puisses bien le visualiser) comme tu peux l'avoir, tout s'emboîte bien donc l'item est vrai ! Petits tips : - Dans cet item on coupe l'insert et le vecteur avec l'enzyme PaeI, comme c'est la même enzyme tu peux être sûr que les bouts s'emboîteront donc tu n'as pas besoin de faire tout ça - L'item A est faux car l'insert a la forme bleue et le vecteur a la forme jaune : les bouts se chevauchent mais ne s'emboîtent pas. Il aurait fallut que l'insert soit de la forme rouge pour que ça match Voilà c'était un peu long désolée mais j'espère que c'est plus clair ! Entraîne toi à faire ce genre d'exercice et tu verras que ça deviendra facile Quote
maestro Posted February 9, 2020 Author Posted February 9, 2020 Merci de ta réponse @LanaBanana j'ai bien compris ta réponse est exactement ce que j'attendais! ( merci encore d'avoir pris le temps ) Quote
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