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[carolineb]

Bonjour! je comprends pas pourquoi la mutation peut être détectée par séquençage du produit de PCR, car si j'ai bien compris, le produit de PCR contiendra exon 1 intron 1 et exon 2, mais s'il y a mutation, la PCR ne pourra pas avoir lieu étant donné qu'on n'aura plus d'exon 2 

et du coup pourquoi elle ne pourrait pas être détectée par séquençage du produit de RT-PCR? 

merci d'avance!

[liza]

Salut, ce qu’il faut se dire que même si il y a une mutation dans l’ADN ce dernier ne sera pas modifié donc la PCR pourra être réalisée puisque le site de l’amorce n’est pas supprimé dans l’ADN génomique . En revanche sur une RT-PCR on part de l’ARN donc l’exon 2 est supprimé donc on a plus le site pour l’amorce donc dans ce cas on ne pourra réaliser la RT-PCR et donc tu ne pourras pas détecter la mutation  

[carolineb]

@liza mais pourquoi l'ADN ne sera pas modifié par la mutation?

[liza]

Parce que ton ADN est génomique donc il a été obtenu à partir d’une cellule après extraction  et qu’une excision ne se fait que lors de l’épissage et donc sur de l’ARN  

[carolineb]

@liza mais du coup même si l'ADN est touché par la mutation ça n'aura pas de conséquence pcq il subira pas d'excision? j'ai du mal à comprendre, en fait l'ADN génomique c'est avant l'excision donc s'il porte la mutation ça fait rien par contre quand on à la transcription on va exciser les introns pour avoir l'ARNm et là vu qu'on avait une mutation sur l'intron 1 quand on va avoir l'épissage, l'exon 2 partira en même temps que que l'intron 1 c'est ça? mais du coup on pourra même pas faire de reverse transcriptase si? 

[liza]

En fait tu as deux matériels de départ et deux techniques différentes pour chacun :

- en PCR : on utilise l'ADN donc les introns et les exons 

- en RT-PCR : tu n'as que les exons et tu as retiré les introns puisque tu as produit  l'ARNm à partir de ton ADN donc si il y a une mutation dans les introns qui entrainent une excision d'un exon, ton site d'hybridation reconnu par les amorces n'existera plus  

[carolineb]

@liza ok j'ai compris merci bcp!

et juste dernière question, la T4 ligase elle agit que sur les extrémités franches ou elle peut reconnaitre les franches et cohésives? car dans mon cours elle peut reconnaître les deux contrairement à celle de E coli qui elle ne reconnaît que les bouts collants

[liza]

De rien !  

L'ADN ligase de E. Coli ne reconnait que les bouts cohésifs tandis que la T4 ADN ligase agit autant sur les bouts francs que sur les bouts cohésifs  

[carolineb]

@liza (désolée je te dérange encore un peu)

ici je comprends pas pourquoi les items B et D sont faux, sachant que la T4 ligase agit sur tout..

[liza]

La T4 ligase agit sur tout mais elle n'agit que en faisant une liaison entre deux enzymes qui font des bouts cohésifs OU entre deux enzymes qui font des bouts francs  

Pour la D, les extrémités ne sont pas compatibles puisque si tu regardes tes deux extrémités de chaque coté elles ne sont pas complémentaires et donc il ne peut pas y avoir de liaison  

[carolineb]

@liza ah d'accord merci! 

mais pourtant la C est comptée juste alors que c'est pas complémentaire non plus 

[liza]

Pour savoir deux enzymes sont complémentaires : 

- En 1er:  tu regardes si elles coupent toutes les deux au même niveau = si il reste le même nombre de base au niveau des extrémités 

- En 2nd : tu regardes les bases entre la coupure de chaque coté et si c'est les mêmes elles sont complémentaires 

Par exemple pour la C : BAMH1 et BcII tu as une base avant la coupure donc pour l'instant c'est bon ; et la séquence entre la première base (G et T) et la dernière (C et A) c'est GATC pour les deux donc elles sont complémentaires  

Tu as compris ? 

[carolineb]

@liza oui merci bcp! et les bases aux extrémités par contre ne sont pas obligatoirement les mêmes c'est ça? sinon ça serait la même enzyme donc je pense pas mais je préfère demander aha

[liza]

Oui c'est ça