sanger

[Wonder]

Bonjour, où doit se trouver le fluorochrome dans la méthode de Sanger pour ne pas gêner l'élongation ? De plus, je ne suis pas sure d'avoir bien compris mais on répète la méthode à chaque fois 4 fois ? 

[juliewsr]

Salut !

Dans la méthode de Sanger, les fluorochromes sont accrochés au ddNTP, et certes ils bloquent l'élongation mais ce n'est pas un problème puisque c'est déjà le cas avec les ddNTP ! 

En gros, le principe de la méthode de Sanger c'est :

- Une sorte de PCR, donc il te faut une amorce, et un milieu contenant des dNTP "normaux" et des ddNTP liés à des fluorochromes (de couleur différente selon la base). (diapo 126)

- Et avec ca, tu fais des cycles de PCR normaux, donc ca va générer plein plein de brins. Selon le principe de la PCR, l'ADN POL va synthétiser le brin en ajoutant les nucléotides complémentaires du brin que tu veux séquencer. Or, dans ton milieu, tu as des dNTP (en excès), donc qui vont s'intégrer le plus souvent et prolonger les brins. Mais parfois, c'est un ddNTP qui va s'incorporer ! Et la, ca bloque l'élongation et ca forme un brin plus court. (diapo 127)

Du coup à la fin, tu as plein de brins de la même séquence (issue de la meme PCR), mais plus ou moins finis. Y'a tellement de cycle de PCR, qu'il y en a au moins 1 de 1 base, 1 de 2 bases,  1 de 3 bases .... 1 entier. Chaque brin commence par l'amorce, puis le début de séquence en dNTP et se finit par un ddNTP fluorescent. 

 

Tout ces brins, tu en fait une electrophorese → ca va les ranger par taille ! Sur la feuille tu aura une sorte de ligne, avec tous les fragments quitte suivent, de taille très proche (à 1 base près quoi).

Enfin, tu regardes ta feuille de plus près, pour pouvoir regarder quel fragment émet quelle couleur (donc se finit par telle ou telle base) et tu va pouvoir déterminer l'ordre des bases (diapo 128, 129, 130)

 

Voila j'espère que c'est clair ! 

 

[Wonder]

Le 13/12/2019 à 23:27, juliewsr a dit :

Salut !

Dans la méthode de Sanger, les fluorochromes sont accrochés au ddNTP, et certes ils bloquent l'élongation mais ce n'est pas un problème puisque c'est déjà le cas avec les ddNTP ! 

En gros, le principe de la méthode de Sanger c'est :

- Une sorte de PCR, donc il te faut une amorce, et un milieu contenant des dNTP "normaux" et des ddNTP liés à des fluorochromes (de couleur différente selon la base). (diapo 126)

- Et avec ca, tu fais des cycles de PCR normaux, donc ca va générer plein plein de brins. Selon le principe de la PCR, l'ADN POL va synthétiser le brin en ajoutant les nucléotides complémentaires du brin que tu veux séquencer. Or, dans ton milieu, tu as des dNTP (en excès), donc qui vont s'intégrer le plus souvent et prolonger les brins. Mais parfois, c'est un ddNTP qui va s'incorporer ! Et la, ca bloque l'élongation et ca forme un brin plus court. (diapo 127)

Du coup à la fin, tu as plein de brins de la même séquence (issue de la meme PCR), mais plus ou moins finis. Y'a tellement de cycle de PCR, qu'il y en a au moins 1 de 1 base, 1 de 2 bases,  1 de 3 bases .... 1 entier. Chaque brin commence par l'amorce, puis le début de séquence en dNTP et se finit par un ddNTP fluorescent. 

 

Tout ces brins, tu en fait une electrophorese → ca va les ranger par taille ! Sur la feuille tu aura une sorte de ligne, avec tous les fragments quitte suivent, de taille très proche (à 1 base près quoi).

Enfin, tu regardes ta feuille de plus près, pour pouvoir regarder quel fragment émet quelle couleur (donc se finit par telle ou telle base) et tu va pouvoir déterminer l'ordre des bases (diapo 128, 129, 130)

 

Voila j'espère que c'est clair ! 

 

merci beaucoup !