Levade

[Michael_Scott]

Bonjour, 

Je voudrais savoir comment on peut reconnaître un polymorphisme sur un gène à partir de résultats observés chez plusieurs individus ? 

 

Par ailleurs, comment savoir si une inactivation est préférentielle sur le chromosome paternel ou maternel à partir d'une PCR d'ADN génomique d'un enfant et de ses 2 parents ? 

 

Merci. 

[léléGT]

Hello !

 

Je ne suis pas sure de bien comprendre la première question, de quelle type d'expérimentation parles-tu ?

 

Concernant l'inactivation préférentielle, en général on travaille avec 2 enzymes : l'une coupe le brin non methylé, l'autre coupe le brin peu importe sil est methylé. On considère que si le brin n'est pas coupé par la première enzyme alors le gène est methylé, donc on a une inactivation préférentielle.

Tu ne peux pas savoir avec exactitude par simple PCR de quel chromosome il s'agit, dans les exercices il faudra faire attention à la nuance entre les affirmations et les "peut etre"

 

 

[Michael_Scott]

Merci pour la question 2.

Pour la 1ère, j'ai fais un exercice où j'avais des résultats d'une PCR de 3 personnes de la même famille. Il était demandé si un polymorphisme existait sur ce gene. 

[léléGT]

Je pense qu'il s'agissait de voir si les enzymes coupaient toutes ou non selon les individus, si elles ne coupaient pas toutes alors on considère qu'il y a un polymorphisme 

[Lilette]

Coucou @Michael_Scott!

Pour ta première question dans ce genre d'exercices tu vois qu'il existe un polymorphisme génétique si tu détectes plusieurs allèles de tailles différentes en faisant ta PCR avant digestion par une enzyme de restriction. Si c'est après c'est dû à la coupure mais si c'est avant ce ne sont pas des produits de coupure mais bien des allèles différents montrant qu'il existe bien un polymorphisme.

 

Dans cet exemple (amplification du chromosome X et enzyme de restriction sensible à la méthylation), il existe 4 variants alléliques, tu le sais parce que tu as 4 bandes de taille différente sans enzyme. Tu peux aussi dire que le témoin et le patient 2 sont des femmes (2 chromosomes X) dont l'inactivation est au hasard pour le patient 2 (50%-50% père-mère) et préférentielle pour le témoin (un seul chromosome est méthylé dans l'organisme).

Le patient 1 est sûrement un homme (un seul chromosome X non méthylé).

[Noel_Flantier]

Bonjour @Lilette serait-il que tu explicites un peu plus en détail ton raisonnement pour en déduire que le patient 1 est probablement un homme (car je pensais que l'enzyme ne coupait pas vu qu'il n'y a aucune bande et donc que le chromosome X est méthylé)

De même pourrais-tu expliquer comment on trouve l'inactivation équilibrée pour le patient 2 ?

 

Un grand merci d'avance

[léléGT]

Hello @JPCORRA !

 

Pour la patient 1 sans enzyme on voit bien une seule bande, lorsque le fragment d'ADN est mis en présence de l'enzyme et on n'observe aucune bande cest la conséquence de l'action de l'enzyme sur le fragment, ce dernier a été coupé et ne peut donc plus être révélé dans ce gel. De ces obsrrvation tu déduis qu'un chromosome a bien subi une digestion, donc il y avait 1 X.

 

De manière general comme un seul X subit la digestion (puisque l'autre serait methylé), alors en présence d'enzyme tu verrais apparaître au moins une autre bande qui représenterait le chromosome X methylé si tu avais eu affaire à une femme.

 

Ici le chromosome X a subi la digestion donc "disparait"

[Moumou]

il y a 38 minutes, JPCORRA a dit :

Bonjour @Lilette serait-il que tu explicites un peu plus en détail ton raisonnement pour en déduire que le patient 1 est probablement un homme (car je pensais que l'enzyme ne coupait pas vu qu'il n'y a aucune bande et donc que le chromosome X est méthylé)

De même pourrais-tu expliquer comment on trouve l'inactivation équilibrée pour le patient 2 ?

 

Un grand merci d'avance

 

Dans ce genre de QCM il faut faire attention au moment où coupe l'enzyme (avant ou après PCR) :

- Une coupure avant amplification se traduit par une absence de bandes 

- Une coupure après amplification se présente par la présence de deux bandes de taille plus petite 

L'enzyme coupe la séquence quand elle n'est pas méthylée.

 

Dans cet exemple, la coupure a lieu avant la PCR donc 

Pour le témoin :

Présence de deux bandes avant coupure puis une seule bande après coupure par un enzyme sensible à la méthylation.

C'est une femme car après coupure, on observe qu'il reste une bande donc au moins un de ses chromosomes est méthylé. La méthylation ne se fait que chez les femmes donc c'est une femme.

L'inactivation est biaisée car on ne voit qu'une seule bande après clivage par l'enzyme. SI l'inactivation avait été équilibrée on aurait eu deux bandes (identiques à celles observées sans l'enzyme) car chaque chromosome aurait été inactivé au hasard (50% pour l'un et pour l'autre)

Elle est hétérozygote car tu observes deux bandes différentes en absence d'enzyme elle possède deux allèles différents d'un même gène.

Cela veut dire que cette femme est hétérozygote et que le phénomène d'inactivation de l'X est biaisé chez elle.

 

Le patient 2 : 

Même réflexion. C'est une femme hétérozygote avec une inactivation de l'X équilibrée.

 

Patient 1: 

C'est un homme car il ne possède aucune bande après clivage par l'enzyme donc pas de phénomène d'inactivation de l'X.

 

J'espère que c'est plus clair.

 

[Noel_Flantier]

Un grand merci @Moumou @léléGT pour ces explications qui sont super claires !

[Noel_Flantier]

@Moumou je me demandais également s'il aurait été possible d'obtenir après action de l'enzyme (ici après PCR) pour le patient 1 :

 

-1ere possibilité : une bande à 150 et une à 50 ? Si oui, dans ce cas, l'analyse aurait été la même, c'est-à-dire un homme ?

 

-2nde possibilité : une bande à 200, une à 150 et une à 50 ? Si oui, dans ce cas là quelle aurait été l'interprétation ?

 

Merci encore !

 

[Moumou]

il y a une heure, JPCORRA a dit :

@Moumou je me demandais également s'il aurait été possible d'obtenir après action de l'enzyme (ici après PCR) pour le patient 1 :

 

-1ere possibilité : une bande à 150 et une à 50 ? Si oui, dans ce cas, l'analyse aurait été la même, c'est-à-dire un homme ?

 

-2nde possibilité : une bande à 200, une à 150 et une à 50 ? Si oui, dans ce cas là quelle aurait été l'interprétation ?

 

Merci encore !

 

 

Pour la possibilité 1 : 

Alors pour le patient 1 dans la mesure où l'enzyme coupe avant de faire la PCR, c'est impossible d'avoir ces deux bandes. 

Mais en supposant que tu obtienne après clivage par l'enzyme ces deux bandes ça voudrait dire : 

1. Que la PCR a eu lieu AVANT la digestion par l'enzyme 

2. Que l'enzyme a coupé le fragment en 2 fragments de 50 et 150 pb

Et donc là oui on pourrait conclure que le patient 1 est un homme à condition qu'il n'y ait pas de 3eme bande de 200 pb (sinon c'est que c'est une femme). Mais vraiment là l'important c'est de regarder si l'enzyme coupe avant ou après la PCR, j'ai l'impression que c'est ça qui te pose problème.

 

Pour la possibilité 2 : 

C'est ce que j'ai dit au dessus, si tu obtiens ce profil c'est  que : 

1. La PCR a eu lieu AVANT la digestion par l'enzyme 

2. Il y a un phénomène d'inactivation de l'X et donc on est en présence d'une femme homozygote 

 

Avec plaisir !

 

 

[Noel_Flantier]

@Moumou C'est parfait, merci beaucoup !

Et dans le cas de la femme homozygote, l'inactivation de l'X sera équilibré ou biaisé ?

[Michael_Scott]

Bonsoir, 

Merci beaucoup @Lilette et @léléGT pour vos éclaircissements.

Bonne soirée.