Techniques de génome

[Michael_Scott]

Bonsoir, 

Je ne comprend pas le principe des cycles dans la PCR. Quelqu'un pourrait me l'expliquer ? 

Merci. 

[Liliputienne]

Commençons par le commencement (c'est toujours mieux) : à quoi ça sert, la PCR ? A multiplier une séquence désirée du DNA à étudier. 

 

Attention en PCR on parle bien du DNA, mais en RT-PCR on parle du RNA ! Si déjà tu pars avec ça en tête pour les exos, tu t'éviteras des pièges qui se glissent facilement. 

 

Ensuite le mécanisme (ici on parlera de la PCR) :

 

En premier lieu de quel matériel tu vas avoir besoin pour travailler ? D’une DNApolymérase appelée Taqpolymérase (thermorésistante c’est mieux parce qu’il va falloir chauffer ta tambouille !) et donc logiquement de dNTP comme substrats. Tu vas avoir besoin de 2 amorces aussi, l’une appelée amorce “sens” puisqu’orientée de 5’ -> 3’ et l’une “anti-sens” puisqu’orientée de 3’ -> 5’.

 

Maintenant place à la préparation ! 

 

Tu as une séquence de DNA que tu souhaites amplifier pour mieux l’étudier pour cela tu vas utiliser un couple d’amorces complémentaire des bornes de ta région que tu veux amplifier. 

 

Tout d’abord tu vas procéder à la dénaturation de ton DNA, parce qu’il est double brin mais que tes amorces ne te sont utiles que sur du simple brin. Pour cela tu fais chauffer le DNA, et tu sépares ainsi les 2 brins. Ensuite tu peux hybrider tes sondes ! Tu as une sonde sens et une sonde anti-sens (pour que cela “encadre” la zone encore une fois). S’en suit la synthèse de DNA par la DNA polymérase, vu qu’on part de 2 brins après son intervention on obtient 4 brins. Donc le double de brins de départ ! Et ainsi de suite pour environ 50 cycles (1 cycle étant : dénaturation + hybridation + synthèse). 

 

On distingue par la suite 2 types de PCR  : la qualitative et la quantitative. 

 

En PCR qualitative : 

Toute ta tambouille prélable (le milieu réactionnel si tu préfères) et l'ADN matrice sont mis sur gel d'agarose. Vu que tu as amplifié de façon importante tu peux visualiser la migration dans le champ électrique ! 

 

Maintenant attention à la lecture des résultats ! Tu peux toujours avoir des contaminations (bande non désirée qui apparait) ou des amplifications parasites (généralement nombreuses petites bandes de taille inférieures). 

 

Petit tip: si tu veux enlever les amplifications parasites tu peux faire une PCR nichée ! C’est à dire prendre des amorces qui s’hybrident à l’intérieur de ton couple d’amorce inital pour pouvoir augmenter ta stringence. 

Par contre pour les contaminations, va falloir te récoltiner tout le boulot ! Aucun moyen d’y remédier !  

 

En PCR quantitative:

C’est en temps réel ! Du direct ! C’est à dire que tu vas visualiser à chaque cycle l’évolution de ton système. 

 

Ici on distingue 3 phases : 

1- La phase exponentielle : c’est celle où tu dépasses le seuil de détection 

2 - La phase intermédiaire 

3 - La phase finale où tu atteins le plateau, tu ne pourras pas obtenir plus de DNA 

(Je te laisse aller voir à quoi ressemble une courbe de PCR quantitative pour la beauté de la sigmoïde)  

 

J’espère que la PCR n’a plus de secret pour toi ! 

 

Et petit conseil : je te conseille vivement d’aller en ED de génome, la chargée de TD que j’avais l’an dernier l’avait expliqué super clairement ! 

 

Bon courage

 

[Michael_Scott]

Merci, mais tout cela je l'ai compris déjà. C'est pas ma PCR que je ne comprend pas, mais juste le mécanisme des cycles avec l'histoire de l'extrémité 3' variable. 

[léléGT]

Bonjour !

 

Est ce que tu pourrais être plus précis sur ce que tu ne comprends pas stp ? Il y a beaucoup de choses à dire sur les PCR

 

Concernant les extrémités 3' variable, on parle là du premier cycle de PCR, la brin est synthétisé dans le sens 5'-->3', or en 3' lors de l'élongation la polymerase peut aller plus ou moins vite, donc on dit que le 3' est variable (sous-entendu en taille), le 5' correspondant a l'amorce est donc stable.

 

Attention en exos on estime que ces erreurs seront corrigées au fur et à mesure des cycles, donc pas à prendre en compte dans les exos.

Edited November 25, 2019 by léléGT

[Michael_Scott]

Bonjour, 

Ce que je ne comprend pas c'est pourquoi on dit qu'au bout de 30 cycles, on produit 2 familles d'amplicons 

- 100 000 copies du PCR 

- et 30 copies ayant des extrémités 3' variables

 

[léléGT]

Cest ce que je viens de t'expliquer, dans les premiers cycles la taile est légèrement variable puisque l'amplification peut etre trop courte ou trop longue, mais pour le deuxième cycle on n'amplifie que les séquences possédant la complémentaire de l'amorce (les séquences ayant subit une amplification trop faible dans le premier cycle ne sont donc pas amplifiées) donc finalement les erreurs de taille d'elongation s'estompent, on obtient par exemple 30 copies variables et 100 000 de taille souhaitée 

[Michael_Scott]

D'accord. Merci beaucoup.