RT-PCR

[Guest Theo]

Bonsoir,

Dans le cours du Dr. LANGIN, je n'arrive pas à comprendre ce qu'est le RT-PCR et son fonctionnement ( ainsi que la distinction avec le northern blot et la RT-PCR quantitative). 

Si quelqu'un pouvait m'expliquer ce serait génial.

Merci d'avance.

[Josibed]

Bien le bonsoir!

Alooors premièrement toutes les techniques que tu as citées ont un point commun, elles étudient les ARN mais pas de la même façon!

1. En RT PCR tu vas partir d’un ARN sauf que la PCR ne fonctionne qu’avec de l’ADN Bicaténaire puisque je te le rappelle tu dénatures tes brins pour synthétiser les fragments complémentaires et ainsi obtenir rapidement une MEGAAAA quantité d’ADN via la répétition de cycles dénaturation/synthèse/dénaturation ....donc que faire?
   • Tu pars de ton ARN qui possède donc (chez les eucaryotes) une queue poly A
   • tu utilises une amorce oligodT qui d’hybride avec la queue poly A
   • tu peux donc utiliser la transcriptase inverse qui à partir d’ARN te synthétise un brin d’ADN complémentaire (le génome c’est magique n’est ce pas #HPforever). 
   • Tu isoles ton brin d’ADN mono caténaire via la NaOH ou RNase H qui dégrade le brin d’ARN et ne fonctionne QUE sur hybride ADN/ARN!
   • comment synthétiser le brin complémentaire? Hé bien il te faut une amorce pour la DNA pol 1 OR l’amorce oligo dT se situe dans le mauvais sens de lecture QUE FAIRE!!?
   • tu rajoutes via la transférase terminale une séquence de dCTP en 3’ de ton brin monocaténaire 
   • BINGO tu rajoutes une amorces complémentaires oligodG et ta DNA pol I peut commencer sa synthèse de brin via son activité polymérase de 5’ en 3’ 
   • Tu obtiens finalement de l’ADN bicaténaire ayant la séquence de ton ARN, tu réalises ensuite une PCR classique qui te permet de faire migrer tes merveilleux fragments sur une électrophorèse
2. Mais quel est la différence avec le northern Blot? Hé bien c’est beaucoup moins compliquer puisqu’il te suffit de faire migrer DIRECTEMENT tes ARN pour les étudier en électrophorèse. Mais pourquoi se compliquer la vie alors? Parce que les ARN sont beaucoup plus instables que l’ADN et donc plus difficile à étudier et source de plus d’erreurs de manipulation (s’il y a des traces de RNase A tu peux être sur que tes ARN seront dégradés par exemple).
3. Enfin, la différence avec la  RT PCR quantitative or mis que se sont deux techniques toooootalement différentes c’est que :
   • en Northern tu fais directement migrer ton extrait d’ARN donc l’EPAISSEUR DE LA BANDE est proportionnelle à la quantité d’ARN récoltée!
   • en RTPCR tu étudies le nombres de cycles qu’il t’a fallu pour obtenir la quantité d’ADN voulu donc le nombre de cycles est INVERSEMENT proportionnel à la quantité d’ARN récoltée au départ (moins tu as besoin de faire de cycle plus tu avais beaucoup d’ARN).

J’espère que mon explication a été plus claire que notre cher professeur Langhin et que tu pourras faire de beaux rêves de migration d’ARN.

Bonne nuit  

 

[Michael_Scott]

D'accord. Super. Merci. 

Ps : désolé j'ai pas pu répondre avant j'avais un problème de connexion.