Rangueil 2016, item 13A

[Hello82]

Bonjour, je ne comprends pas la justification donnée dans le qcm 13 de Rangeuil 2016, item A.

Cf sujet :

 

[Bestusernameever]

coucou ! 

 

C'est tout simplement dû au fait de les bouts produits par les enzymes dont on parle ne sont pas complémentaires entre eux, donc l'insert ne pourra pas s'insérer dans le vecteur comme voulu. Il faut regarder les séquences libres produites par chaque enzyme et ensuite les comparer aux autres pour voir si il y a complémentarité des bases. Dans ce QCM là tu vois que certains nucléotides sont is en face d'eux même, donc il n'y aura pas d'insertion 

[Hello82]

Hi !

Je comprends pas, quand je fais la notation de mes séquences d'enzymes sur le vecteur et le cDNA tout colle. La justification qui a été donnée est fausse selon moi, car les sens 5' -> 3' ne sont pas respectés en haut et en bas.

[Hello82]

[Bilskur]

il y a une heure, Hello82 a dit :

Je comprends pas, quand je fais la notation de mes séquences d'enzymes sur le vecteur et le cDNA tout colle. La justification qui a été donnée est fausse selon moi, car les sens 5' -> 3' ne sont pas respectés en haut et en bas.

Je vais compléter ce qu'as dit mon co-RM

Pour commencer, c'est un QCM du Pr. Levade, et dont la correction est officielle, donc on essai de retranscrire pourquoi il considère cet item faux. 

Si tu regardes le polylinker, tu vois que le site pour SaII est placé en 5' du site de HindIII. 

Donc ça oui tu pourrais insérer ton cDNA mais il se mettrait à l'envers, puisque l'ouverture HindIII est en 5' du cDNA mais en 3' du vecteur. 

 

C'est assez clair?  

[Hello82]

Merci c'est plus clair,

 

J'ai refais le schéma et je ne tombe sur le même résultat que dans le sujet mis en ligne en 1er (

 

Moi je trouve :

Vecteur

 Sall                                                      HindIII

    5'  ------------                            AGCT----------   3'

  3'    -----------AGCT                             ----------  5'

 

Mais tout d'abord, je ne savais pas que ça comptais la position des enzymes de restriction dans la séquence ( savoir que Sall est placé avant HindIII ). Ensuite, toi même tu dis que "à l'envers"  (rotation à 180°) ça correspondrait, or le sens n'est pas précisé ici, il n'y a pas marqué "dans les 2 sens" dans l'énoncé. Donc l'item peut être juste alors ??

 

Edited April 28, 2019 by Hello82
erreur

[Bilskur]

Je suis d'accord avec toi pour ta modélisation, il y a bien une erreur dans le sujet précédent. 

Par contre, l'énoncé de l'item dit bien que la manoeuvre doit parvenir aux objectifs, donc on veut que la séquence soit dans le sens codant. 

Ici si tu le mets inversé, ça marche mais ça ne codera pas, donc ça n'a pas d'intérêt, l'item est donc bien faux. 

 

Pour ce qui est de la place dans le polylinker, je l'interprète comme ça, mais perso, j'ai surtout toujours considéré que le Pr. Levade met dans son item les enzymes dans l'ordre 5'-3' dans le bon sens.

 

[Hello82]

Ah merci bcp de ta réponse @Bilskur !!! Je suis rassuré pour le Schéma

Ok bah, je ferai comme tu dis à l'avenir concernant le sens d'écriture sur le Polylinker MCS; par contre c'est vraiment tiré par les cheveux dire que c'est faux car "ce n'est pas dans le même sens que le sens codant" lol

Pour aller plus loin : Du coup, avec une bonne séquence, ça ne codera pas pour la résistance à l'Ampicilline, vu que la séquence qui code pour la résistance à son sens orienté à l'opposée du sens de la séquence du Promoteur ?

[Bilskur]

Il y a 22 heures, Hello82 a dit :

par contre c'est vraiment tiré par les cheveux dire que c'est faux car "ce n'est pas dans le même sens que le sens codant

Non ce n'est pas tiré par les cheveux  

Dans l'énoncé il stipule clairement que les items portent sur l'expérience qu'il mène et que du coup il veut savoir ce qui lui permettrait d'avoir le résultat attendu. 

Ici, le cDNA ne s'intègrera pas dans le bon sens, donc il ne sera pas traduit, ou pas correctement, donc ça ne donnera pas ce que tu veux  

 

Il y a 22 heures, Hello82 a dit :

Du coup, avec une bonne séquence, ça ne codera pas pour la résistance à l'Ampicilline, vu que la séquence qui code pour la résistance à son sens orienté à l'opposée du sens de la séquence du Promoteur ?

La séquence ne changera rien au gène de l'ampicilline étant donné qu'elle est intégrée autre part. 

Ce gène sert juste à la sélection des plasmides, et non, le fais qu'il soit à l'envers n’empêche pas l'expression, vu que leur ADN est circulaire et donc lu dans les deux sens  

[Hello82]

D'accord, merci @Bilskur !

J'ai demandé à côté au Pr Levade sur Moodle, voici sa réponse : << En effet, l'item A propose une digestion qui permettrait d'insérer le cDNA dans le vecteur, les extrémités des fragments XhoI et SalI étant compatibles (pouvant être recollées)... Mais cela ne répondra pas aux objectifs de l'énoncé (qui exige que "...toute la partie codante du cDNA soit placée en aval du promoteur PCMV..."). Vu l'orientation du promoteur sur le plasmide, le cDNA inséré selon l'item A serait alors placé dans la mauvaise orientation. Vous ne pourriez pas exprimer le LDLR. >> (sujet intitulé :  Pr Levade - Concours 2016, QCM 13, item A , lien : https://moodle.univ-tlse3.fr/mod/forum/discuss.php?d=76326 )

 

[Hello82]

Mais je ne comprends pas, vraiment, désolé. C'est bien en aval ( situé après le promoteur ) et normalement ça reste codant puisque 5' reste en 5' et 3' reste en 3' en inversant la séquence du cDNA en miroir ...?

[Hello82]

Voici ce que j'obtiens quand "j'inverse" la séquence du cDNA. Et pour comprendre si ce serait codant ou pas, j'ai utilisé au hasard deux "marqueurs" (lol ce sont juste des séquences au hasard, imaginées dans le cDNA que j'ai marqué au fluo pour pouvoir les "suivre" après avoir inversé la séquence du cDNA).

[Bilskur]

J'avoue que je ne comprends pas bien ton problème. 

Une séquence génique n'est généralement pas palindromique, donc tu n'auras pas la même chose si tu inverses en miroir comme tu le dis. 

Tu auras le complémentaire à la place du brin codant, mais le complémentaire identique au brin codant.

Si jamais tu as un gène qui est mettons : (5')ATG AAG ATT TAG(3'), son brin complémentaire sera donc  (5') CTA AAT CTT CAT (3') 

Tu te retrouves donc avec le brin que tu dis "miroir" qui pourra s'insérer grâce à la complémentarité des enzymes de restrictions, mais ici tu n'as pas l'ATG de départ, et tu n's pas les mêmes protéines à l'arrivée si jamais tu pouvais transcrire le brin. 

 

C'est assez clair?