Maxine Posted May 5, 2014 Posted May 5, 2014 Bonjour, J'ai fais le concours de l'année dernière, et il y a deux items qui me posent soucis: 1) Des cellules endothéliales sont exposées à l’acétylcholine, en présence de concentration croissante de trois analogues de la L arginine. La production résultante de GMPc a été mesuré et exprimé en % --> La figure 1 (qui montre une décroissance du % de GMPc) montre que les 3 analogues testés sont des inhibiteurs de la guanylate cyclase soluble. Noté FAUX... Enfaite ce qui me pose problème ici c'est le "soluble", comment sait on si il s'agit de soluble ou de membranaire ? 2) On dispose d'une ADNc et d'un plasmide: ADNc : EcoRI -----------------------------------XhoI Plasmide MCS : EcoRI------------------------------------XhoI EcoRI : G/AATTC XhoI : C/TCGAG ---> L'insertion de l'ADNc dans le plasmide dans la bonne orientation peut être obtenue par digestion de deux, par les enzymes EcoRI et XhoI : VRAI Je n'arrive pas à voir comment c'est possible.... J'ai un peu (beaucoup) oublié comment on fait, et j'ai du mal :/ Pouvez vous m'aider ?? Merci
Guest Estellle Posted May 5, 2014 Posted May 5, 2014 1) Dans le cours on parle de guanylate cyclase soluble qui produit le GMPc (second messager de la relaxation). Donc ça pourrait être la raison du "soluble". Mais je t'avoue que je n'en mettrais pas ma main à couper 2) Ce qui est important c'est que ton brin soit insérer dans le bon sens: c'est à dire que ton brin s'il est transcrit doit l'être en premier par son ATG, donc le sens de lecture du brin doit correspondre au sens de transcription du plasmide. Au niveau du MCS tu as aussi un ATG : il correspond au début du MCS. Le début de ton ADNc doit donc se coller du côté le plus proche du début du MCS. En général on coupe le MCS en 2 endroits. 1 de ces 2 endroits est plus proche du début que l'autre: ici c'est ECOR1 (si on coupe le plasmide avec ECOR1 et XHO1). Or quand on coupe notre ADNc avec ECOR1 ça coupe aussi au début. Donc le début de l'ADNc correspondra au début du MCS. Même raisonnement avec XHO1. (ATTENTION: c'est important qu'au niveau de l'ADNC les site de coupure soit en-dehors de la séquence codante: avant l'ATG et après le codon stop) Si tu n'a toujours pas compris n'hésite pas à le dire j'essaierais d'expliqué autrement
Maxine Posted May 8, 2014 Author Posted May 8, 2014 Salut, Merci de ta réponse Je ne vois pas vraiment comment on peut être si certain, sans passer par les lettres .... Je me souviens, au 1er semestre, il fallait faire comme une simulation: Découper, et remettre ensemble les morceaux pour voir, par exemple si C allait bien avec un G, et A avec un T .... Pas là ? Merci
Solution Guest Ambre Posted May 8, 2014 Solution Posted May 8, 2014 Bonjour, alors pour ta question 2, il y a 2 choses importantes pour ce type de question : 1) Premièrement, ce qui est important ici c'est l'ordre des sites de restriction dans ton plasmide. Ici on a d'abord EcoRI puis XhoI. Or dans ton ADNc, tu as un site EcoRI au début et un site XhoI a la fin. Donc ici, lorsque tu soumettras les plasmides et l'ADNc à ces 2 enzymes, les sites de restriction seront coupés et lorsque que le plasmide et l'ADNc seront mis en présence l'un de l'autre, alors les sites EcoRI du plasmide et de l'ADNc s'associeront car ils sont compatibles ( puisqu'ils ont été coupé par EcoRI tous les 2 ) et les sites XhoI s'associeront ( car ils ont été coupés par XhoI tous les 2 donc compatible. ). Donc ton ADNc sera normalement inséré dans le même ordre de lecture que celui de ton plasmide. 2) Deuxièmement, il est important de vérifier cependant, que ces 2 enzymes EcoRI et XhoI ne sont pas compatibles entre elles car sinon l'ADNc pourrait s'insérer dans l'un ou l'autre des sens, indifféremment, et il serait donc dans 50% des cas dans le bon sens et dans 50% des cas dans le sens inverse au sens de lecture du plasmide. Et c'est pour vérifier qu'elles ne sont pas compatibles que tu fais une "simulation en coupant et recollant" : Pour EcoRI on a G/AATTC ==> G CTTAA/G CTTAA Pour XhoI on a C/TCGAG ==> TCGAG GAGCT/C C Finalement : GTCGAG CTTAAC On voit ici que ces 2 enzymes ne donnent pas des bouts compatibles donc il n'y a pas de risque que l'ADNc s'insère dans un autre sens que le sens de l'ordre des sites de restriction. Voilà j'espère que c'est plus clair. (Estelle j'espère que tu ne m'en voudras pas ^^) Bonnes révisions.
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