enzyme de restriction et insertion

[Juju]

bonjour, je voulais savoir si on veut integrer un ADN dans un plasmide ou vecteur faut -il coupé par 2 enzyme sur le plasmide ET l'ADN ou une coupure suffirait sur le palsmide?parce que qu'il y ait une coupure (du coup sans perte de morceau) ou deux (perte d'un morceaux) du plamide il y aurait une ouverture pour L'ADN a integrer.

faut-il que les enzyme ouvrant l'ADN soit les memes que celle du plamide?

 

merci par avance (desole si c'est un peu flou....)

[sebban]

Généralement il y a 2 sites de restriction autour du gène d'intérêt (afin de véritablement l'isoler et pas simplement l'ouvrir), et un seul site nécessaire sur le vecteur. Les polylinkers présentent des successions de sites de restriction uniques afin de, justement, être certain que par rencontre avec telle enzyme de restriction le plasmide sera clivé sur l'unique exemplaire de son site de restriction.

[Bilskur]

Salut  

 

En fait, tout va dépendre de ton vecteur et de ton cDNA  

Tu peux très bien utiliser la même enzyme de restriction sur les 2 si jamais elle fonctionne, c'est à dire si elle est dans ton polylinker du vecteur, et si elle reconnaît une séquence avant l'ATG et après le STOP de ton cDNA.  

Donc tu peux très bien ouvrir une seule fois ton vecteur, et le traiter par phosphatase alcaline pour qu'il ne se referme pas sur lui-même. Par contre, le cDNA, il faut "extraire" la séquence codante, mais tu peux avoir la même enzyme qui coupe aux deux extrémités.  

 

Mais c'est très peu probable  

Du coup tu vas souvent utiliser 2 enzymes différentes (qui souvent produisent des extrémités différentes) sur le cDNA pour extraire la séquence codante, et utiliser soit les mêmes enzymes sur ton vecteur si elles sont dans le polylinker, et sinon, tu utilisera des enzymes qui reconnaissent des séquences similaires et qui sont compatibles. 

Ce qui fait que tu dois souvent extraire une partie de ton vecteur, mais c'est simplement pour t'adapter aux extrémités du cDNA  

 

In fine, tu peux avoir 1 seule enzyme de restriction, comme tu peux en avoir 4 à utiliser  

C'est assez clair?