Trouver le sens de l’insertion

[TinkyWinky]

Bonsoir, lorsqu'on fait un clonage non orienté, je n'ai pas compris comment on différenciait le plasmide dans le sens d'intérêt du plasmide dans le sens qui ne nous intéresse pas. La prof a évoqué une méthode selon les paires de bases, en mettant à profit les enzymes de restriction, mais ça n'est pas très clair ^^ Est-ce que quelqu’un aurait compris ce passage du cours ?

[PierrickSenior]

Yesssss, coucou,

Du coup selon l'exemple de la prof on a effectivement réalisé une méthode où on compare les pb des différents fragment.

-Tout d'abord, on a pu remarqué que dans le gène d'intérêt sélection il y avait un site de restriction pour l'enzyme Xho1, site qui est aussi présent sur l'ADN plasmide. 

-Le truc était que en fonction de si on avait l'insert dans le bon sens ou non, la place de Xho1 du gène d'intérêt était différente ettttt c'est ça qu'on a voulu analyser. 

-Donc on a calé notre enzyme Xho1 avec les vecteurs, on à donc eu deux sites de restrictions (un sur le vecteur et un sur le fragment):

• Pour le "mauvais" sens on avait Xho1 sur l'insert positionné en 1210 et Xho1 sur le vecteur positionné en 2760 (il est tjr position ainsi lui)
• Pour le "bon" sens on avait Xho1 pour l'insert positionné en 2000 et Xho1 sur le vecteur en position 2760 tjr

Donc après action de l'enzyme on remarque les fragment de 

• 760 et 6050 correspond au bon fragment, qu'on pourra donc purifier, et produire une prot recombiante
• 1550 et 5260 correspondant au mauvais fragment à éliminer (enfin comme bon te semble )

Je sais pas si j'ai été clair, donc dis moi ? 

[niptuck]

il y a 20 minutes, PierrickJunior a dit :

Yesssss, coucou,

Du coup selon l'exemple de la prof on a effectivement réalisé une méthode où on compare les pb des différents fragment.

 -Tout d'abord, on a pu remarqué que dans le gène d'intérêt sélection il y avait un site de restriction pour l'enzyme Xho1, site qui est aussi présent sur l'ADN plasmide. 

 -Le truc était que en fonction de si on avait l'insert dans le bon sens ou non, la place de Xho1 du gène d'intérêt était différente ettttt c'est ça qu'on a voulu analyser. 

-Donc on a calé notre enzyme Xho1 avec les vecteurs, on à donc eu deux sites de restrictions (un sur le vecteur et un sur le fragment):

• Pour le "mauvais" sens on avait Xho1 sur l'insert positionné en 1210 et Xho1 sur le vecteur positionné en 2760 (il est tjr position ainsi lui)
• Pour le "bon" sens on avait Xho1 pour l'insert positionné en 2000 et Xho1 sur le vecteur en position 2760 tjr

Donc après action de l'enzyme on remarque les fragment de 

• 760 et 6050 correspond au bon fragment, qu'on pourra donc purifier, et produire une prot recombiante
• 1550 et 5260 correspondant au mauvais fragment à éliminer (enfin comme bon te semble )

Je sais pas si j'ai été clair, donc dis moi ? 

bien vu @PierrickJunior

[TinkyWinky]

il y a une heure, PierrickJunior a dit :

• 760 et 6050 correspond au bon fragment, qu'on pourra donc purifier, et produire une prot recombiante
• 1550 et 5260 correspondant au mauvais fragment à éliminer (enfin comme bon te semble )

C'est plus claiir ouii mais je ne comprends pas pourquoi c'est ces valeurs qui correspondent au "bon" ou "mauvais" même quand tu dis 1210 par exemple correspond au mauvais.. comment on le sait?

[ISB]

il y a 18 minutes, TinkyWinky a dit :

C'est plus claiir ouii mais je ne comprends pas pourquoi c'est ces valeurs qui correspondent au "bon" ou "mauvais" même quand tu dis 1210 par exemple correspond au mauvais.. comment on le sait?

Yop, il faut avoir le codon ATG dans le même sens que le promoteur, sinon au aura transcription de l'ADN en ARN mais si y'a pas l'atg y'aura pas de traduction de l'ARN donc c'est dans ce sens là qu'il faut faire attention au sens

[TinkyWinky]

il y a 2 minutes, ISB a dit :

Yop, il faut avoir le codon ATG dans le même sens que le promoteur, sinon au aura transcription de l'ADN en ARN mais si y'a pas l'atg y'aura pas de traduction de l'ARN donc c'est dans ce sens là qu'il faut faire attention au sens

Ouhh je viens de voir que c'était AGT et pas ATG en effet!!^^ Thanks @ISB

Merci beaucoupp @PierrickJunior

[PierrickSenior]

il y a une heure, TinkyWinky a dit :

Ouhh je viens de voir que c'était AGT et pas ATG en effet!!^^ Thanks @ISB

Merci beaucoupp @PierrickJunior

Pas de souciiis 

Il y a 2 heures, niptuck a dit :

bien vu @PierrickJunior

Je commence à être expert en compréhension de Bettina