Chap 5 vecteurs/prot recombinantes/transgenese

[MamyLaPoudre]

Bonjour ! Désolée de faire appel à vous en ce 24 mais j'aimerai savoir quel est l’interêt de la transfection transitoire si au final le plasmide n’est pas intégré et est dégradé ?

 

quel est le rôle de l’intron dans la transgenese additive? Est ce que c’est parce que comme ça se « rapproche » du gène naturel il y a plus de Chance que la séquence soit intégrée ?

 

Dans la recombinaison homologue je ne comprend à quoi sert le gene TK

J’ai bien compris qu’il apporte une sensibilité au ganciclovir mais pourquoi détruire les sequences recombinantes?  

 

Merci d’avance

 

 

 

 

Edited December 24, 2018 by millapauline

[ggath]

Coucou, 

Alors oui dans le cas de la transgenèse additive le rôle des introns est effectivement de paraître plus "naturel"

 

Dans la recombinaison homologue, effectivement le TK (Thymidine Kinase exactement) va induire une sensibilité au ganciclovir. Il faut bien comprendre qu'à la différence du NEOr, le TK est ajouté à l'extrémité de la séquence que tu veux remplacer. Tu as 3 cas : 

- La séquence ne s'insère pas : tu n'as pas ton NEOr, donc sensibilité au G418 --> la cellule meurt
- La séquence s'insère mais pas de manière homologue : ton NEOr est présent donc les cellules sont résistantes au T418 MAIS le TK reste présent lui aussi, tes cellules sont donc sensibles au ganciclovir. Ici c'était des cellules que tu ne voulais pas sélectionner parce que la séquence s'est certes insérée mais pas au bon endroit. 

- La séquance s'insère au bon endroit, on a recombinaison homologue : le NEOr sera présent tu as donc résistance au G418, mais le TK étant à l'extérieur, il ne va pas s'insérer dans le génome, la coupure se fera juste avant. Donc les cellules ne sont pas sensibles au ganciclovir. 

 

Donc justement le ganciclovir permet de détruire les séquences non recombinantes, là où il y a eu insertion au hasard. Regardes les schémas des deux diapos en fin de poly sur la construction du vecteur dans les transgenèses de recombinaison et sur la recombinaison homologue. 

 

Dis moi si ça reste un peu flou après ça 

 

Bon courage 

[MamyLaPoudre]

Hum oui c’est beaucoup plus clair merci @ggath !

juste par rapport à la transfection transitoire quel est son intérêt si au final le plasmide n’est Pas intégré ? ( et dégradé)

[ggath]

Alors j'ai cherché dans le poly et vu l'endroit où il en parlait l'an dernier en tout cas, a mon avis c'est juste pour faire un opposé avec la transfection stable sachant que c'est elle que l'on souhaite obtenir. C'est juste pour vous faire comprendre que tout ne marche pas super bien du premier coup et qu'on a des raté 

Je ne vois que ça ... 

[MamyLaPoudre]

D’accord donc il ne faut pas plus s’en soucier alors .. merci beaucoup !! 

[ggath]

Honnêtement je ne pense pas, derien !