Protéine de fusion/protéine recombinante

[PP17]

Bonsoir, 

 

J'ai du mal à différencier protéine de fusion et protéine recombinante.

Est-ce qu'il est obligatoirement nécessaire de digérer l'ADNc et le plasmide avec une seule et même enzyme de restriction (EcoRI dans le poly) pour obtenir une protéine de fusion ?

 

Merci   

[Kermit]

Salut

 

je laisse quelqu'un d'autre répondre mieux que moi pour la première question.

 

pour la seconde, tout dépend (selon moi, à confirmer donc) de si tu veux avoir une insertion orientée ou non de ton ADNc dans ton plasmide. Je m'explique : si tu digère le 5' et 3' des deux (plasmide et ADNc) avec une même enzyme de restriction : l'insertion peut se faire dans n'importe quel sens. Pareil si c'est avec deux enzymes de restrictions compatibles. Tu peux avoir les deux schémas suivants :

plasmide xxxxxx3' 5' ADNc 3' 5'xxxxx plasmide

ou bien

plasmide xxxxxx3' 3' ADNc 5' 5'xxxxx plasmide

 

Or, si tu digères avec deux enzymes différentes non compatibles (une pour le 3' plasmide/5' ADNc et lautre pour le 3'ADNc/5' plasmide) tu auras ce qu'on appelle une insertion ORIENTÉE (un seul sens d'insertion possible) puis production de ta protéine et ce qui en suit 

 

j'espère ne pas avoir dit de bêtises 

[Sakamain]

Salut,

 

Protéine de fusion = protéine d'intérêt + étiquette, et protéine d'intérêt = protéine modifiée où l'on a inséré une nouvelle séquence (recombinante)

 

Il y a 2 heures, Kermit a dit :

tout dépend (selon moi, à confirmer donc) de si tu veux avoir une insertion orientée ou non de ton ADNc dans ton plasmide.

Hum par rapport à ça je pense que l'on veux tout le temps une insertion orientée et dans le bon sens, sinon ça n'a pas grand intérêt, ce qui va changer c'est si on va l'obtenir + ou - facilement

 

Il y a 7 heures, HernieFiscale a dit :

Est-ce qu'il est obligatoirement nécessaire de digérer l'ADNc et le plasmide avec une seule et même enzyme de restriction (EcoRI dans le poly) pour obtenir une protéine de fusion ?

Et du coup Kermit l'a bien expliqué, en fait le choix de l'enzyme en sois n'est pas vraiment important dansa le sens où tu as plusieurs possibilités.

Le truc auquel il faut faire gaffe c'est si en digérant l'ADNc/ le plasmide avec telle ou telle enzyme(s) on a des extrémités cohésives qui permettront une bonne orientation et un bon sens (bonne orientation = insertion de l'ADNc dans le plasmide possible que d'une seule manière, bon sens = l'ADNc est inséré dans le plasmide de telle façon que son ATG et son STOP se suivent dans le sens de lecture (et non pas STOP puis ATG)), et de là tu fais des déductions.

 

PS: tu parles de ECOR1 dans le poly, attention, si tu parles de la diapo 223 : On a effectivement que ECOR1 mais : le prof à bien précisé que là c'était un clonage non orienté et qu'on avait qu'1/6 de chance d'avoir un plasmide recombinant; parce que dans la séquence génique qui nous intéresse de bloquer on n'a qu'un site ECOR1 et du coup pas trop le choix: on clone dans ECOR1. Lorsque on veut être plus précis, on clone la séquence entre deux sites avec extrémités non compatibles (diapo 221).

Edited December 24, 2018 by Cachka

[Kermit]

Le 24/12/2018 à 09:35, Cachka a dit :

Hum par rapport à ça je pense que l'on veux tout le temps une insertion orientée et dans le bon sens, sinon ça n'a pas grand intérêt, ce qui va changer c'est si on va l'obtenir + ou - facilement

 

Non mais je suis d'accord quon veut une insertion orientée mais j'utilise simplement le lexique généticien qui stipule ca lol 

[PP17]

 

@Kermit @Cachka

Merci beaucoup à vous deux c'est tres clair maintenant !! 

Edited December 26, 2018 by HernieFiscale