IPTG et insertion d'ADNc

[fannymeli72]

Bonjour, je me demande lorsqu'on insère un fragment s'il s'insère plus en Nter ou Cter. Et également est ce que la petite partie restante a niveau du plasmide de la séquence enlevé se situe elle toujours en Nter ou peut-elle être en Cter. 

Je me demande aussi quand on utilise IPTG cela permet l'induction,donc est ce que si on a IPTG et XGAL c'est toujours obligatoire d'avoir des colonie bleues? Car on pourrait juste avoir l'induction par l'IPTG mais tout de même le fragment inséré synthétisé et donc XGAL serait pas coupé? 

[TICTAQ]

Salut ! 

 

Alors concernant tes questions

 

Je suppose que tu parles de l'insertion d'ADNc dans un plasmide, si c'est de ça que tu parles, l'insertion de ton fragment sera dépendante de l'emplacement de tes 2 enzymes de restrictions non compatibles, il ne faut pas vraiment savoir si c'est plus en Nter ou Cter. 

Les parties restantes sur le plasmide seront celles situées en dehors des enzymes de restrictions. Le but est d'avoir une protéine recombinante.

 

Par contre si tu parles de protéines de fusions :

Lorsque ton fragment est inséré grâce à une seule enzyme de restriction, il s'insère au milieu de la séquence lac Z.

Le fait de s'insérer au milieu de cette séquence (en gardant à l'esprit qu'il faut que tes ATG soit en phase) formera une protéine de fusion, il y aura donc une partie de lac Z en Nter et une autre en Cter.

La séquence Lac Z étant coupée en 2 parties, la B-Galactosidase (traduite à partir de lac Z) ne sera pas exprimée. Par contre, si ton ADNc ne s'insère pas, ta séquence lac Z sera complète, et la B-galactosidase sera traduite.

 

ADNc non inséré : B-Galactosidase va couper X-Gal (contenu dans le milieu) : Colonies bleues (elle coupe aussi le lactose)

ADNc inséré :  pas de B-galactosidase tu auras des des colonies blanches

 

IPTG permet l'induction de la protéine recombinante (de fusion), il empêche le répresseur de la séquence de se fixer à l'opérateur et permet la transcription de la protéine.

X-Gal ici ne te sert qu'à reconnaître tes colonies exprimant (ADNc inséré et plasmide transfecté) ou n'exprimant pas (ADNc non inséré, plasmide transfecté, car résistance aux antibiotiques du milieu) la B-Galactosidase grâce à l'apparition d'un chromogène. Si il n'y avait pas ce composé tes colonies se ressembleraient toutes.

 

Il est presque impossible de n'avoir que des colonies blanches statistiquement (en présence de X-Gal)

 

Je sais pas trop si ces explications t'ont éclairé... N'hésite pas à me reposer des questions pour que j'explique mieux certains points si jamais ! Cette partie du cours est assez logique lorsqu'on prend point par point.

 

A bientôt 

 

[fannymeli72]

@TICTAQ merci pour ton explication, je viens de comprendre ce que je n'avais pas tilté.  

Oui désolé ma question était pas très claire :S