Clonage dans un plasmide + extrémités sortantes

[LB2]

Hellooo 

Alors j'ai compris le clonage donc ne vous tuez pas à écrire un pavé de 1000 mots (vive la #SSH ❤)

Mais je n'étais pas en accord avec une amie donc si quelqu'un peut me confirmer ou infirmer ça serait top ! Alors voilà, au moment de l'intégration de l'ADNc, j'ai écrit qu'il y a recréation des liaisons phophodiesters entre le 5'-P et le 3'-OH. Cependant, vu qu'il y a l'application d'une phosphatase alcaline et qu'on a plus que des extrémités 5' et 3' OH, je voulais savoir si cela était correct ? Je pense que oui car il y a bien des phosphates sur la diapo, mais sont-elles aux extrémités 5' ? Je me doute de la réponse mais j'aimerais être sûre à 100% ahah.

 

Et ensuite pour les extrémités sortantes, si quelqu'un pourrait m'expliquer car je n'ai pas bien saisi ce que c'était.

 

Merci d'avance 

[Cactus]

Salut @LB2

 

Je vais essayer de reprendre en 2/2 tout le processus du clonage dans un plasmide avec mes explications et tu comprendras sûrement (je l'espère)

 

Tu coupes ton plasmide dans la région MCS par une enzyme de restriction, tu génères des extrémités 5'P

Si tu essaies d'y insérer de l'ADN étranger avec une ligase à ce moment là, rien ne se passe car le plasmide préfèrera se refermer sur lui même, plus simple que d'accueillir un inconnu 

 

Il va donc falloir que du déphosphore les extrémités 5'P pour pas que le plasmide s'auto-ferme sur lui même, tu utilises donc une phosphatase alcaline (P>OH)

 

Si tu ajoutes l'ADN étranger avec des extrémité 5'P à ce moment là, tu pourras recréer une liaison phosphodiester (ATP + Ligase bien sur) 

Sauf que : tu n'as que 2 liaisons phosphodiester formées, car les 2 autres tu as 5'OH au plasmide et 3'OH à l'ADN étranger.

Les 2 dernières liaisons phosphodiesters seront formées dans la bactérie, donc tu ne t'inquiètes pas, no problem !

 

It's ok ?

Edited October 13, 2018 by Cactus

[LB2]

Oui j'avais compris ça déjà je l'ai précisé au début ! Mais merci de ta réponse hyper détaillé ! Du coup tu as quand même répondu à ma question alors merci  

 

Du coup pour les extrémités sortantes ?

[Cactus]

Les extrémités sortantes de l'ADN étranger seront : 5'P et 3'OH 

Les extrémités sortant du plasmide seront : 5'OH et 3'OH 

 

C'est ça ta question ? 

[LB2]

Ah c'est ça que je voulais Merci !!!

 

Je ne suis pas sûre d'avoir compris ce qu'étaient les extrémités sortantes, est ce que tu sais ?

[Cactus]

Salut @LB2 !

 

Alors je me suis mal exprimé, les extrémités sortantes ce sont vraiment les extrémités qui dépassent 

Genre sur cette diapo les extrémités sortantes ce sont les extrémités 5' 

 

Du coup pour être plus juste dans mon explication : 

Extrémités sortantes de l'ADN étranger : 5'P

Extrémités sortantes de du plasmide : 5'OH 

 

Les extrémités 3' ne dépassent pas, même si ce sont des extrémités elles ne sont pas considérés comme "sortantes"

Edited October 14, 2018 by Cactus

[LB2]

D'accoooord !

Et dans le cadre des endonucleases de restriction c'est pareil ? 

Merci de ta réponse en tout cas

[Magnum]

Dans le cadre d’endonucléase c’est exactement pareil, tu libères du 5’P et du 3’OH  

[santiago]

Cela depend des endonucléases certaines génèrent des extrémités 5' sortantes et d'autre des extrémités 3' dotantes

[Magnum]

Oui mais rien à voir avec 5’P et 3’OH @santiago  une extrémité sortant ou pas sera en 5’ un phosphate 

[LB2]

Merci @Magnum pour ta réponse ! Je n'ai plus de questions merci