Ber/Ner, sonde southern Blot, méthode Sanger

[minuscortex]

Bonjour à tout le monde,

 

Après une longue soirée à passer en revue toutes les diapo du chap II de notre cher Mr Langin j'ai quelques mystères à résoudre !!!

 

- Je ne saisis pas bien la grande différence entre les systèmes Ber et Ner. Selon le poly du TAT ( qui est super bien soit dit en passant  !!! ) Ber = pb de Base et Ner = pd de Nucléotide, mais désolée si ça parait très con pour moi une base c'est par ex un A et donc un nucléotide. Donc what's the difference ????

 

- diapo 107 je n'ai pas bien compris le principe de la sonde RActive. Je comprends qu'on introduit une sonde ( donc un enchaînement de nucléotides fluo ) pour repérer une séquence. Mais du coup cela veut dire qu'on sait ce qu'on cherche pour pouvoir fabriquer la sonde en adéquation ? Par ex si on se dit qu'on cherche 100 bases ( au hasard hein !!! )  on va mettre une sonde de 100 bases complémentaires de la séquence recherchée ? et ainsi si elle apparaît, c'est qu'elle est là ?

 

- pour la méthode Sanger, là je nage complet. Je ne sais même pas quelle question vous poser ! 

 

Voilà voilà ! je ne sais pas si une personne en forme aujourd'hui aura le courage de répondre tout ça, (mais je l'espère fortement !!! ) 

 

Bon "week-end" à tous 

 

 

 

 

[matt]

Bon alors pas sûr que je puisse répondre à toutes tes questions de manière super claire mais je vais faire de mon mieux 

 

1.  BASE = A, U, T, G, C ; nucléotide = Nucléoside (base + (d)ribose) + ton groupement mono, di ou tri phosphate (regarde les diapos 12 et 15 pour visualiser)

 

      2. La méthode Sanger (ouais je fais pas dans l'ordre sorry).

 

Grossomerdo, tu prends ton ADN que tu veux séquencer, pleins de dNTP, de l'ADN pol I et beaucoup moins de ddNTP (pour pas que ton élongation s'arrête à chaque fois au bout de 3 bases) et of course une amorce pour pouvoir commencer ta réplication.

Donc tu mets tout ton p'tit monde dans une éprouvette mais tu choisis un ddNTP (mettons le ddGTP ici, à noter que chaque ddNTP aura sa fluorescence propre). A chaque fois qu'un ddGTP sera incorporé ton élongation sera arrêtée donc tu auras un truc du genre :

 

xxxxxxxxxxddGTP

xxxddGTP

xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxGTP

xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxddGTP

 

BREEEEF, t'as capté le concept quoi, et au final tu superposes le tout et ça te donne :

xxxddGTPxxxddGTPxxxxxxxxddGTPxxxddGTP

 

Puis te refais le même procédé en changeant de ddNTP (et ceci pour le ddATP, le ddTTP et le ddCTP), au final tu peux lire le tout avec une électrophorèse. Tu pourras ainsi visualiser ton brin complémentaire de ta séquence de départ (voir la l'image ci-jointe)

 

Et vu que t'es malynx, tu n'oublies de changer T par A, G par C (puisque c'est ici ton brin complémentaire que tu as sous les yeux), et aussi ne pas oublier d'inverser le sens pour être de 5' en 3', pour avoir la séquence de ta séquence de départ

 

Voilà voilà, c'est pas hyper clair puis c'est surement erroné (attendons confirmation)

 

J'espère que ça t'a un minimum aidé, bonne journée

 

 

 

[LB2]

Bonjour @minuscortex ! Ceci est une tentative de réponse, sûrement ne sera-t-elle pas complète, que quelqu'un n'hésite pas à me compléter ou à me reprendre si je dis trop de bêtises hihi

 

• Le système BER va réparer une base qui n'est pas complémentaire, c'est à dire qui est modifiée pour reprendre les termes du poly ALORS QUE le système NER  corrige des modifications structurales de la double hélice qui a été modifié par des pontages, autrement dit des liaisons covalents intra ou inter brins entre 2 bases. 

Pour le système BER c'est une base car au final on va juste remplacer le U par un C (l'exemple dans le poly), à n'importe quelle étape de ce système il y a conservation du phosphate et du sucre.

Pour le système NER c'est un nucléotide car on va tout modifier : l'ensemble base+sucre+phosphate

 

• Je t'avoue que là je sèche, attend la réponse de mes collègues

 

• Pour Sanger, il faut retenir que dans l'élongation il y a incorporation de dNTP et parfois, quand il y a incorporation de ddNTP et bien l'extrémité 3'-OH n'est plus disponible donc on ne peut plus incorporer de nucléotides, l'élongation s'arrête. Ça c'est pour la diapo 125.

Pour la diapo 126, on a un ADN de vecteur(=plasmide) qui sert de matrice, il contient un ADN complémentaire ou ADNc c'est à dire une copie d'ARNm après transcriptase inverse de l'ADN (mais ça on le verra dans le chap III). Donc on rajoute une amorce pour faire un élongation, on ajoute de l'ADN pol I + dNTP +ddNTP, à l'arrêt de l'élongation on obtient un monobrin marqué. Avant on utilisait de la radioactivité pour le dNTP, maintenant on utilise de la fluorescence pour les amorces ou le ddNTP (autrement dit les extrémités) et cette fluorescence sera détectée par une caméra, elle permet de détecter chacun des brins en fonction de leur taille. Tu peux connaitre le ddNTP incorporé car les 4 ddNTP ont une fluorescence différente (diapo 127).

Pour les diapos 128 et 129, j'avoue que même en doublante je ne suis pas encore sûre mais en tout cas j'ai marqué qu'on a une élongation de chacun des couples, et que certaines élongations s'arrêtent au 1er T (pour le A), au 2e, etc .... en fonction de la présence ou non de ddNTP.

 

J'espère que cela a pu répondre à certaines de tes questions, je m'excuse par avance s'il y a une erreur quelque part, et bon week end à toi aussi

[minuscortex]

Merci à tous les deux. J'ai compris pourquoi la séquence s'arrête quand un on a un ddNTP et qu'on le verra par électrophorèse car il sera fluo MAIS je ne comprends pas comment ça peut nous aider à séquencer la totalité du brin matrice puisque par ex si le ddNTP est incorporé après 16 bases de dNTP, comment savoir quelles sont ces dNTP ?

 

[LB2]

Et bien tout simplement par complémentarité de ta matrice ! Si l'élongation s'arrête à 16 bases par exemple comme tu dis, tu as juste besoin d'appliquer la complémentarité des bases en échangeant le sens bien sûr et le tour est joué  J'ai trouvé que cette explication