Exercice transgénèse LEVADE

[lili226]

Bonjour  concernant le concours de Rangueil 2017, le QCM 9 me pose problème

 

item D. je mettrais l'item faux mais je ne suis pas sûr de ma justification : pour inactiver un gène il faut placer un cassette (NeoR ou TK peu importe) au milieu d'un exon. En conséquence seule la cassette 2 sera responsable d'une inactivation de gène. Pour moi l'item est faux car la cassette 2 peut être indifféremment TK ou NeoR et il y aura quand une inactivation (la cassette 1 ne jouant aucun rôle d'inactivation ici)

 

item E. je ne comprends pas pourquoi cet item est faux 

Pour moi si l'on veut réaliser la sélection des cellules qui auront fait la recombinaison homologue comme proposé dans l'item il faut que la cassette 1 = TK et la cassette 2 = NeoR

En conséquence, la cassette 1 sera éliminé et la cassette 2 reste présente

Vu que la cassette 2 reste au milieu de l'exon 3, selon moi il y aura bien une inactivation du gène et BIEN DANS TOUTES les cellules ES sélectionnées car cellules n'ayant pas fait la recombinaison homologue seront tuées par le Gancyclovir...

 

Merci d'avance

 

 

[pj31]

Salut @lili226 !

Item D : C'est bel et bien faux mais attention c'est faux car au milieu tu dois avoir la cassette Neo et sur les extrémités la cassette Tk, rappelle toi dans le cours on dit que Neo doit être en plein milieu de ton transgène ce qui permet de faire la selection positive et Tk doit être aux extrémités pour faire de la sélection négative !

 

Item E : Pas forcément les 2 allèles inactivés: pour sélectionner les cellules qui ont intégré le transgène on va faire une double sélection (positive et négative), ainsi les cellules qui ont intégré le transgène seulement sur 1 allèle (donc qu'un seul allèle inactivé) seront aussi sélectionnées vu qu'elles contiennent bien le transgène, certe sur 1 allèle seulement mais c'est suffisant pour résister au Gancyclovir

 

Bonne soirée 

 

 

[lili226]

coucou @pj31 , merci pour tes réponses 

 

pour la D. j'ai effectivement zappé le début de l'item...

Petit bilan juste pour être sûr que c'est clair pour moi :

Pour permettre la recombinaison homologue (RH) on va utiliser les cassettes de sélection NeoR et TK.

Dans le schémas du QCM, la cassette 2 devra être NeoR (=sélection + = résistance au G418) et la cassette 1 devra être TK (=sélection - = sensibilité au Gancyclovir)

Lors de la RH, la cassette 2 est conservée et la cassette 1 est éliminée ce qui permet aux cellules d'être à la fois résistance au G418 et au Gancyclovir, les autres cellules ayant fait la recombinaison  aléatoire conservent la cassette 1 = TK et donc meurent

Le transgène obtenu a conservé la cassette 2 au milieu de l'exon 3, le gène sera donc bien inactivé 

 

PS/ petite question si on avait fait la RH mais que la cassette 2 ne se trouvait pas au milieu de l'exon 3, il n'y aurait pas d'inactivation de gène ?

 

Merci d'avance et désolé pour ce long message 

 

[pj31]

Il y a 3 heures, lili226 a dit :

coucou @pj31 , merci pour tes réponses 

 

pour la D. j'ai effectivement zappé le début de l'item...

Petit bilan juste pour être sûr que c'est clair pour moi :

Pour permettre la recombinaison homologue (RH) on va utiliser les cassettes de sélection NeoR et TK.

Dans le schémas du QCM, la cassette 2 devra être NeoR (=sélection + = résistance au G418) et la cassette 1 devra être TK (=sélection - = sensibilité au Gancyclovir)

Lors de la RH, la cassette 2 est conservée et la cassette 1 est éliminée ce qui permet aux cellules d'être à la fois résistance au G418 et au Gancyclovir, les autres cellules ayant fait la recombinaison  aléatoire conservent la cassette 1 = TK et donc meurent

Le transgène obtenu a conservé la cassette 2 au milieu de l'exon 3, le gène sera donc bien inactivé 

 

PS/ petite question si on avait fait la RH mais que la cassette 2 ne se trouvait pas au milieu de l'exon 3, il n'y aurait pas d'inactivation de gène ?

 

Merci d'avance et désolé pour ce long message 

 

En fait le principe de l'inactivation par RH c'est vraiment d'insérer un transgène qui est ressemblant au gène que l'on veut invalider mais qui possède des modifications qui font que les séquences codantes (exons) ne seront plus exprimées. Ici si tu enlève la cassette 2 et que tu laisse comme ça en recollant les 2 bouts, le transgène risque de ne pas être assez homologue avec le gène deja de base... Par contre peu importe ce que tu mets, cassette néo ou pas, le plus important c qu'il faut que cela modifie assez la séquence du gène pour que le transgène qui a pris la place du gène naturel ne soit pas exprimé !

 

J'espère que j'ai été clair....

Bonne journée