Encore immuno....

[nico34]

Re bonjour, je suis dans ma lancé de questions pour l'immunologie.....

 

PURPAN 2015 :

QCM 2 : J'ai un peu de mal à comprendre le fonctionnement et les résultats qu'on observe quand on fait une immunoprécipitation puis un immunotransfert. Je n'arrive pas bien à comprendre quand on réalise ces deux méthodes consécutivement, si quelqu'un pouvez m'apporter un petit coup de main?

Ensuite, l'item E " La PrPsc présente une conformation spatiale modifiée par rapport à la PrPc" Compté Vrai. Je ne vois pas trop les informations qui nous permettent d'y répondre si ce n'est l'énoncé qui indique que l'objectif de ces exercices est de vérifier que la PrPsc a une conformation spatiale différente. 

 

RANGUEIL 2015 : 

QCM 4 : ITEM D : " l'AC1 reconnait un épitope séquentiel de la pré-P absent sur la P-mat " compté vrai.Je ne comprends pas du tout cette réponse. Pour moi, nous avons un anticorps monoclonal ( en théorie ne reconnait un seul épitope ) qui dans l'énoncé a un marquage uniquement cytoplasmique. Puis en immunotransfert, on a une bande à 200 kDA qui doit surement correspondre à la Pré-P, puis une autre bande de 40kDA reconnu. Mais je ne comprends pas ce résultat....

QCM 5 : ITEM B : je ne comprends pas bien cet item ainsi que " anticorps secondaire de chèvre anti IgG de lapin..", pourquoi de chèvre? on ne devrait pas prendre des IgG humaine et non de lapin?

 

RANGUEIL 2014 : 

 En ce qui concerne la méthode semi-quantitative du Dot blot, l'intensité du marquage (0, 1, 2)  signifie quoi précisément? + l'intensité est élevée + Ac se sont fixés à l'antigène? Car je ne suis pas sure d'avoir la bonne interprétation en ce qui concerne la figure avec les protéines totales et la comparaison des Anticorps monoclonaux et le sérum... si quelqu'un pouvez me préciser l'interprétation ça serait génial..

QCM 5 : item E, je ne comprends pas comment un ELISpot permet de mettre en évidence l'existence de cellules cancéreux CIRCULANTES, pour moi l'ELISport permet de détecter et numérer les hybridomes SECRETEURS d'Ac ou alors des cellules qui SECRETENT des Ag....

 

Desolééééééééééé, pour ce pavé....... J'espère que j'ai été clair.....

[Zuji]

Bonsoir !

 

Purpan 2015 : QCM 2 Item E

 

Immunoprécipitation puis immunotransfert. Il faut savoir qu'un immunotransfert est pratique car facile à réaliser en pratique. C'est plus difficile de révéler une immunoprécipitation qu'un immunotransfert, par exemple.

Du coup il arrive que pour regarder des épitopes conformationnels, on réalise d'abord une immunoprécipitation pour la reconnaissance des épitopes séquentiels ET conformationnels.

Puis on révèle tout, dans le cas de l'exercice, avec un AS. Ainsi, qu'importe les conditions dénaturantes lors de l'IT, l'AS est forcément capable de détecter les antigènes, si ces derniers ont été retenu juste avant lors de l'immunoprécipitation.

En résumé : le couplage Immunoprécipitation puis immunotransfert permet de révéler la présence d'épitopes séquentiels ET conformationnels de manière aisé en pratique au laboratoire.

Il ne faut donc pas être perturbé par l'utilisation d'une technique dénaturante, qui intervient APRES reconnaissance des épitopes conformationnels par les anticorps monoclonaux. L'AS sert donc uniquement de révélateur de protéine ou non.

 

Dans le cas de l'exercice, la présence :

1) de l'IT simple, permettait de voir si on avait reconnaissance d'une épitope séquentiel, de savoir par quel Ac (en l'occurrence l'Ac 1 reconnait un épitope séquentiel commun aux deux formes)

2) de l'IP couplée à une IT, permettait de voir si on avait reconnaissance d'un épitope séquentiel et / ou conformationnel et par quel Ac (en l’occurrence, on retrouve l'Ac1, on a un nouveau Ac2 uniquement avec la forme sauvage).

Par analyse simple de l'énoncé, on peut conclure que l'Ac 2 reconnait un épitope non présent en conditions dénaturantes = conformationnel, qui n'est plus présent chez la forme mutée. L'item E est donc vrai.

 

Rangueil 2015 : QCM 4 Item D

 

Même résonnement pour le couplage immunoprécipitation / immunotransfert, qui permet de révéler des épitopes conformationnels non trouvés en conditions dénaturantes.

L'ajout de furine permet le passage de la forme précurseuse pré-P ( - ) à la forme mature P-mat (+ ).

D'abord, on sait qu'un AS permet de révéler tout les épitopes selon les conditions. On est dans le cas de l'IT uniquement avec des épitopes séquentiels.

On note que l'AS reconnait une bande à 200 kDa pour pré-P, et deux bandes à 160 kDa et 40 kDa pour P-mat. On en déduit que la furine coupe pré-P en deux.

Or, l'Ac 1 ne reconnait qu'une des deux bandes : l'épitope séquentiel n'est présent que dans un des deux bouts coupés. C'est sans doute ce qui permet de conclure vrai.

Nuance : personnellement, j'aurais mis faux. Car rien ne permet de conclure que la bande de 160 kDa est P-mat. Parfois une protéines mature est bien plus petite que son précurseur. Mais je pense que l'item est vrai car on part du principe que la bande à 160 kDa est P-mat.

 

Rangueil 2015 : QCM 5 Item B

 

Tout d'abord, l'utilisation d'anticorps anti IgG permet de révéler des anticorps fixés à des antigènes, qui sont souvent non couplés à des systèmes de détection. On utilise en pratique des IgG anti-IgG de chèvre car bien moins chère et plus faciles à obtenir que des IgG anti-IgG humaines. 

Petit aparté, une IgG est une protéine. Donc c'est un antigène, donc elle peut être reconnut par d'autre anticorps. Donc on peut avoir des IgG anti-IgG.

Ici, l'item te demande, si tu peux révéler l'Ac 2 lié à la protéine mature en utilisant un antisérum AS de lapin dirigé contre la protéine mature, en le révélant avec des IgG de chèvres.

On sait que l'Ac 2 reconnait bien un épitope conformationnel présent sur la protéine P mature (voir QCM 4). Donc avec un IP, non dénaturant, il reconnaitra donc la protéine.

On peut ensuite utilisé l'AS de lapin en IT sur les protéines de l'IP. L'AS se fixera si il y a une protéine. Et on peut donc ensuite révéler le tout avec des Ac de Chèvre anti-IgG de Lapin.
Pourquoi de chèvre anti-lapin et pas chèvre anti-humain ? Car au moment de l'IT, les protéines retenues en IP restent mais pas l'Ac2 sensible aux conditions dénaturantes.

Il reste donc juste l'AS qui peut être révélé en tant qu'anticorps primaire. Et enfin, le choix d'Ac secondaires de chèvre et pas d'humain est arbitraire et lié à la pratique. Mais on "peut". C'est cohérent, l'item est vrai :).

 

Rangueil 2014 :

  "En ce qui concerne la méthode semi-quantitative du Dot blot, l'intensité du marquage (0, 1, 2)  signifie quoi précisément? + l'intensité est élevée + Ac se sont fixés à l'antigène? "

Tout à fait. L'intensité est donc pondérée à plusieurs facteurs : l'affinité des Ac pour l'Ag, la quantité d'Ac, la quantité d'Ag. 0, 1 , 2 etc sont des unités dites "arbitraires" qui permettent de comparer deux résultats entre eux. Tu peux donc interpréter la figure de cette manière : en conditions non dénaturantes, l'AS, l'Ac1, l'Ac2 permettent de reconnaitre en même quantité l'Ag cible dans l'extrait protéique et dans le sécrétome. Donc l'Ag ciblée est donc également un Ag sécrété par la cellule. On peut donc déduire que les cellules cancéreuses libèrent un Ag qui semble être normalement non sécrété par les cellules normales. L'intensité ici avait peu d'importance.

 

QCM 5 Item E :

Pour réaliser l'Elispot dans ces conditions, il suffit de mettre une cellule par "spot", et d'y rajouter des Ac dirigés contre l'Ag sécrété par les cellules C, qui sont bien sécrétrices d'un Ag reconnut par Ac 1 / Ac2 ... Ainsi, parmi les cellules de l'extrait sanguin, si l'ELISpot est positif, on peut conclure en la présence anormale de cellules C cancéreuses circulantes. Je ne vois pas trop ce qui bloque...

 

N'hésites pas si tu as plus de questions ! Bon courage et bonnes révisions .

 

[Zuji]

@nico34 Bonsoir, la réponse a-t-elle suffit ? Bonnes révisions !

[nico34]

Mille mercis pour ton aide @Zuji, vraiment