Recombinaison en transgenèse

[Papa_Dragon]

Bonsoir,

J'ai du mal à comprendre une diapo du cours. Quelqu'un pourrait-il me l'expliquer ?

Pour être plus précis j'ai compris qu'on avait ajouté le gène codant pour l'activité tyrosine kinase et qu'on allait se servir de ça pour sélectionner les blastocytes qui font une recombinaison homologue.(car ceux qui ont une recombinaison homologue n'expriment pas l'activité TK). Alors j'ai pas bien compris ce qu'on essai de faire exactement ni pourquoi l'activité tyrosine kinase n'est présente que chez les recombinants non homologues ?

Est-ce que je suis clair ? En gros cette diapo est confuse pour moi

 

Aussi :

SiRNA = artificiel ou naturel, permet de détruire l'ARNm, miRNA = naturel, transformé en siRNA et shRNA = sorte de miRNA artificiel, transformés en siRNA qui vont détruire l'ARNm (et parfois juste l'inhiber c'est ça ?)

 

Bonne soirée et merci beaucoup à ceux qui me répondront

[ISB]

il y a 23 minutes, Papa_Dragon a dit :

Alors j'ai pas bien compris ce qu'on essai de faire exactement ni pourquoi l'activité tyrosine kinase n'est présente que chez les recombinants non homologues ?

 

Salut, il me semble que si on introduisait dans le cadre de la recombinaison homologue le fragment allant de l'exon 1 au gène codant pour TK la recombinaison ne serait pas homologue mais non homologue. En revanche en introduisant la séquence de l'exon 1 à l'exon 3 on a cette homologie de séquence.

il y a 23 minutes, Papa_Dragon a dit :

 

Aussi :

SiRNA = artificiel ou naturel, permet de détruire l'ARNm, miRNA = naturel, transformé en siRNA et shRNA = sorte de miRNA artificiel, transformés en siRNA qui vont détruire l'ARNm (et parfois juste l'inhiber c'est ça ?)

 

Alors j'ai compris : siARN -> ARN interférant artificiel et shARN aussi est un ARN interférent artificiel mais d'une plus grande taille que le siARN (small interference arn) 

Le miARN est quant à lui naturelle

shARN est découpé en siARN via DICER

 

en tout cas ces arn interférents ont le meme mécanisme interférence, ce sont des arn antisens qui vont se fixer sur l'ARNm de façon complémentaire et antiparallèle empêchant ainsi leur traduction

 

 

Edited April 9, 2018 by ISB

[Roux-carnage]

Salut,

Alors je vais essayer de t'expliquer ce que j'ai compris. En fait il faut que tu relies cette diapo avec la diapo suivante.

Dans cette expérience, on veut récupérer des cellules qui ont été recombinés par recombinaison homologue uniquement. Ces cellules d'intérêt possèdent exon1-NEO-exon3

Le problème, c'est qu'il existe aussi le phénomène de recombinaison non homologue qui ne nous intéresse pas et qui donne exon1-NEO-exon3-TK

 

Du coup, dans un 1er temps, on va sélectionner  toutes les cellules qui ont été recombinés (en homologue ou non). Et dans un 2e temps, on va récupérer seulement les cellules qui ont recombinés par recombinaison homologue.

 

Ensuite, on ne retrouve pas la séquence codant pour TK dans la recombinaison homologue car le génome de souris ne possède pas cette séquence TK. Donc pas d'homologie, donc pas de séquence TK possible en recombinaison homologue.

 

Voila voila

[Papa_Dragon]

@ISB Merci pour la confirmation sur les interférences ! Et pour la recombinaison homologue, j'avais plus ou moins compris ça du coup !

@Roux-carnage 

Citation

Ensuite, on ne retrouve pas la séquence codant pour TK dans la recombinaison homologue car le génome de souris ne possède pas cette séquence TK. Donc pas d'homologie, donc pas de séquence TK possible en recombinaison homologue.

Super ! Il me manquait cette notion pour comprendre la diapo, j'avais pas du tout fait le lien

Par contre si c'est de la recombinaison homologue il devrait y avoir des mutations et donc pas d'activité TK non ? Parce que c'est une recombinaison "au hasard" donc il y a des erreurs ?

Edit : en fait je comprends toujours pas bien comment lire la diapo. D'accord il y a des homologies de séquence mais il se passe quoi concrètement ?

Edited April 9, 2018 by Papa_Dragon

[Roux-carnage]

Alors pour ta 1ère question, je comprends ce que tu veux dire. Mais quand la prof a dit "au hasard", je pense que c'était pour nous simplifier les choses. Après je suis pas sur, mais à mon avis, c'est des mécanismes beaucoup plus complexes qu'un simple ajout/suppression "au hasard". Et même s'il y a des mutations, ça implique pas forcément une perte d'activité enzymatique de TK.

 

Pour ta 2e question, je réfléchis comme ça:

- on introduit dans la cellule de souris le vecteur d'intérêt et le nécessaire pour produire des cassures double brin dans le génome de la souris entre les exons 1 et 3

- la souris va devoir réparer ces cassures. Et pour ça, elle va utiliser la séquence portée par le vecteur (c'est comme si le vecteur était la chromatide soeur). 

- Au cours de la réparation, le génome va synthétiser et introduire la séquence du gène Neo entre les exons 1 et 3

 

Voila, j'espère être clair. C'est pas facile d'expliquer ce genre de trucs en quelques lignes...

[Papa_Dragon]

Je vois... alors je pense que j'ai toutes les clés pour comprendre le cours. Je vais revoir tout ça et relire vos messages demain à tête reposée. Là je risque de m'embrouiller tout seul.

Merci beaucoup en tout cas. Déjà je comprend bien mieux que tout à l'heure

Bonne fin de soirée

 

[ISB]

Il y a 11 heures, Papa_Dragon a dit :

 

Edit : en fait je comprends toujours pas bien comment lire la diapo. D'accord il y a des homologies de séquence mais il se passe quoi concrètement ?

Je te renvoie à cette diapo pour ce qui se passe concrètement avec les homologies de séquences et l'intervention de RAD51

[Papa_Dragon]

Re !

Alors en fait j'ai relu tout ça et j'ai enfin capté.... En fait c'est tout bête mais ce qui me posait problème avec ce que vous m'avez expliqué c'est que j'avais pas bien compris qu'on était sur des sortes de crossing over avec des échanges de matériel génétique. Moi j'étais parti sur l'idée recombinaison homologue = réparation de l'ADN mais bien évidement c'est aussi de l'échange d'ADN et donc de gènes. Du coup je me suis refait les schémas style terminal avec des chromosomes bâtons et j'ai compris !

C'était pas si difficile en fait... en même temps j'étais pas hyper attentif ce jour là

 

Du coup vos explications prennent tout leur sens, encore merci !

 

Bonne soirée

[ISB]

Ah oui d'accord j'avais pas vu ça dans ta question

Pour que la réparation soit homologue il faut un modèle lui permettant de réaliser une synthèse fidèle, donc l'ADN s'apparie avec l'autre brin 

il y a 25 minutes, Papa_Dragon a dit :

en même temps j'étais pas hyper attentif ce jour là

Tu n'étais pas le seul xD

Edited April 10, 2018 by ISB

[sskméta]

Pour rajouter 2 éléments non dit

 

Le shARN est produit par l'expression d'un plasmide transfecté

 

Le miARN est maturé par la Drosha