système Cre-lox

[Son-Goku]

Bonjour !

J'avais une petite question à propos de la technique d'inactivation avec le système Cre-Lox.

 

Les souris qui expriment Cre seulement, et celles qui ont le gène d'intérêt floxé seulement, sont-elles homozygotes ou hétérozygotes ? Ou bien cela n'a pas d'importance et on peut croiser des hétérozygotes jusqu'a obtenir des souris qui expriment à la fois Cre et qui ont le gène floxé ?

 

Ensuite, toujours dans le même registre, mettons que l'on veut inactiver un gène G dans le foie, on fait nos croisements tout ça et l'on obtient une souris qui a G floxé, et qui exprime la recombinase Cre uniquement dans le foie grâce à un promoteur tissu spécifique.

Du coup Cre a forcément été intégré par recombinaison homologue à la place du gène G ? Sinon je ne comprend pas étant donné que la souris est hétérozygote, Cre agira seulement sur l'allèle floxé, mais quid de l'autre allèle où G n'est pas floxé ? On aura quand même transcription et traduction du coup non ?

 

J'espère m'être fait comprendre, surtout sur la 2e partie où j'ai un peu de mal à expliquer mon problème, merci !

[pj31]

Salut ! Alors je penses qu'il y a quelques incopréhensions ....

Pour ta première question : les souris qui expriment Cre peuvent être hétérozygotes ou homozygotes ça n'a pas d'importance vu que dans les deux cas Cre sera exprimé (c'est mieux que ce soit homozygote comme ça Cre est 2 fois plus exprimé mais Si on a pas la possibilité c'est pas grave) . En ce qui concerne le gène floxé, là par contre nous avons besoins de souris homozygote car les 2 brins doivent être floxé vu que l'objectif est de supprimer totalement l'expression d'un gène G. Néanmoins, je pense qu'il est très rare (voir impossible) d'obtenir des souris homozygote pour le transgène d'un seul coup,  je pense qu'on procède dans ce cas là par des croisements successifs pour obtenir des souris homozygotes comme cela est décrit dans le cours. ce qui est sûr c'est que la souris avec laquelle on va croiser la souris qui exprime seulement Cre doit en effet être homozygote.

 

Pour ta 2e question c'est là ou il y a un petit problème de compréhension : la séquence Cre code pour une enzyme qui est capable de couper une séquence donnée encerclée des cassettes "LoxP", donc non Cre n'est pas du tout intégré dans le génome par recombinaison homologue, juste une transgénèse additive suffit puisqu'il suffit que Cre siot exprimé dans les cellules données pour qu'il coupe la séquence donnée. 

 

Et oui tu as raison les 2 allèles doivent être floxés si tu veux suppimer totalement l'expression d'une séquence homozygote (=présente sur les 2 brins). 

J'espère m'être fait comprendre ^^

Bonne journée

[Son-Goku]

Il y a 2 heures, pj31 a dit :

Salut ! Alors je penses qu'il y a quelques incopréhensions ....

Pour ta première question : les souris qui expriment Cre peuvent être hétérozygotes ou homozygotes ça n'a pas d'importance vu que dans les deux cas Cre sera exprimé (c'est mieux que ce soit homozygote comme ça Cre est 2 fois plus exprimé mais Si on a pas la possibilité c'est pas grave) . En ce qui concerne le gène floxé, là par contre nous avons besoins de souris homozygote car les 2 brins doivent être floxé vu que l'objectif est de supprimer totalement l'expression d'un gène G. Néanmoins, je pense qu'il est très rare (voir impossible) d'obtenir des souris homozygote pour le transgène d'un seul coup,  je pense qu'on procède dans ce cas là par des croisements successifs pour obtenir des souris homozygotes comme cela est décrit dans le cours. ce qui est sûr c'est que la souris avec laquelle on va croiser la souris qui exprime seulement Cre doit en effet être homozygote.

 

Pour ta 2e question c'est là ou il y a un petit problème de compréhension : la séquence Cre code pour une enzyme qui est capable de couper une séquence donnée encerclée des cassettes "LoxP", donc non Cre n'est pas du tout intégré dans le génome par recombinaison homologue, juste une transgénèse additive suffit puisqu'il suffit que Cre siot exprimé dans les cellules données pour qu'il coupe la séquence donnée. 

 

Et oui tu as raison les 2 allèles doivent être floxés si tu veux suppimer totalement l'expression d'une séquence homozygote (=présente sur les 2 brins). 

J'espère m'être fait comprendre ^^

Bonne journée

 

Merci de ta réponse, c'est dejà plus clair !

 

Cependant, il y a quelque chose que je comprend pas, c'est comment les 2 allèles peuvent être floxés ?

Mettons que l'on prend une souris homozygote pour le floxage du gène, et une souris qui exprime la recombinase Cre uniquement dans le foie.

Si l'on croise les 2, on aura bien Cre, mais un seul allèle sera floxé non ? Ou alors il y a une subtilité que je ne saisis pas ...

[pj31]

il y a 39 minutes, Gokuleprimant a dit :

 

Merci de ta réponse, c'est dejà plus clair !

 

Cependant, il y a quelque chose que je comprend pas, c'est comment les 2 allèles peuvent être floxés ?

Mettons que l'on prend une souris homozygote pour le floxage du gène, et une souris qui exprime la recombinase Cre uniquement dans le foie.

Si l'on croise les 2, on aura bien Cre, mais un seul allèle sera floxé non ? Ou alors il y a une subtilité que je ne saisis pas ...

Je te mets ce schémas- joint pour pouvoir mieux figurer mes propos : 

Alors en fait c'est la souris qui fera le croisement qui doit être homozygote  pour le gène floxé je pense.

L'autre qui exprime la recombinase Cre doit être une souris qui ne présente pas la séquence du gène G dans son ADN pour que ça marche j'imagine.

Ainsi la souris issue du croisement sera en effet hétérozygote avec un allèle exprimant la recombinase Cre et l'autre allèle qui a le gène floxé. Mais ça ne pose aucun problème car la séquence sera bien coupé et ton gène ne sera plus exprimé. 

Compris?

Bonne soirée

 

[Son-Goku]

Ok super ! On voit sur le schéma que Cre "remplace" le gène donc pas de soucis dallele non floxé, j'avais pas vu sur le poly en noir et blanc ... 

cedt compris merci beaucoup