séquencage anomalie de type footprinting

[Son-Goku]

Bonsoir !

suite au 1er TD de recherche, j'ai encore quelque doutes et interrogations qui subsiste.

tout d'abord, je suis désolé mais je ne pas prendre en photo les QCM, mais cela ne devrait pas poser de problèmes

 

QCM 5: ici, on a inséré un cDNA dans un plasmide, il est encadré par les séquences promotrices des RNApol SP6 et T7.

item E:" ce vecteur permettra de séquencer l'insert en utilisant une amorce qui s'hybride avec le promoteur de la RNA polymérase SP6" VRAI, je ne vois pas trop quelle est la méthode pour séquencer une fois qu'on a hybridé l'amorce, Sanger je suppose, mais si quelqu'un peut m'expliquer dans ce contexte.

 

QCM 12 item E: on nous parle "d'anomalie du profil de footprinting", la chargé de TD a passé rapidement en disant simplement que l'item était VRAI.

je ne sais pas si j'ai loupé quelque chose, mais qu'est ce que ce profil de footprinting ?

 

Merci

[Gardinatops]

Salut ! (reponse partielle)

Pr la 12E ; je pensais que le footpinrting était comme une immuno empreinte (soit le WB) mais d'après wiki non : 

Le footprint ou footprinting de l'ADN est une technique de biologie moléculaire permettant l'identification des protéines et facteurs de transcription se fixant sur une séquence de l'ADN.

Méthode

Cette technique se fait en plusieurs étapes :

Amplification d'ADN par PCR,

Marquage du 5' d'un des deux brin de l'ADN

Incubation de l'ADN amplifié avec des protéines d'intérêt,

Digestion ménagée par une enzyme de type DNAse I (en présence de Ca2+. La réaction sera stoppée avec de l'EDTA (un chélateur de cations permettant d'inhiber et donc de stopper le travail de la nucléase),

Analyse de la longueur des fragments (réalisée par des automates séquenceurs),

Analyse du gel (de polyacrylamide) en conditions dénaturantes (présence de sodium dodécyl sulfate, par exemple)

 

mais Titi a du l'expliquer dans son cours mais je ne l'ai pas sous les yeux ...

[pj31]

Il y a 10 heures, Gokuleprimant a dit :

Bonsoir !

suite au 1er TD de recherche, j'ai encore quelque doutes et interrogations qui subsiste.

tout d'abord, je suis désolé mais je ne pas prendre en photo les QCM, mais cela ne devrait pas poser de problèmes

 

QCM 5: ici, on a inséré un cDNA dans un plasmide, il est encadré par les séquences promotrices des RNApol SP6 et T7.

item E:" ce vecteur permettra de séquencer l'insert en utilisant une amorce qui s'hybride avec le promoteur de la RNA polymérase SP6" VRAI, je ne vois pas trop quelle est la méthode pour séquencer une fois qu'on a hybridé l'amorce, Sanger je suppose, mais si quelqu'un peut m'expliquer dans ce contexte.

 

QCM 12 item E: on nous parle "d'anomalie du profil de footprinting", la chargé de TD a passé rapidement en disant simplement que l'item était VRAI.

je ne sais pas si j'ai loupé quelque chose, mais qu'est ce que ce profil de footprinting ?

 

Merci

Salut ! Je viens appuyé la réponse de @pépé98

 

QCM5 : en effet Sanger est tout à fait possible selon moi ici, pour moi c'est la même méthode que sur un ADN linéaire il y a rien qui change, peut être faudrait-il ouvrir le plasmide pour faire le Sanger mais en tout cas cela peut tout à fait marcher je ne vois pas ce qui te pose pb dis moi !

 

QCM 12 : alors je n'ai pas parlé de ça dans mon cours de l'an dernier et je ne pourrai pas en dire plus que @pépé98, il faudrait voir le QCM entier pour comprendre peut être ....

[LouiseHe]

Team UE8 recherche Titi ( @Théophylline ), je réactive ce sujet, je ne comprends toujours pas de quoi on parle dans l'item E du QCM 12 : "profil de footprinting" ?

Avec ce qui a été dit plus haut, cela voudrait dire que la mutation chez le patient 1 ne permettrait pas de mener l'expérience de footprinting de l'ADN comme on le fait pour le patient normal ?

 

 

 

 

Edited March 2, 2020 by LouiseHe

[Metallica]

Salut @LouiseHe

 

 

Ça t aide ?

[LouiseHe]

@Metallica je comprends l'expérience mais non ça ne répond pas à ma question : de quoi on parle quand on parle de "profil de footprinting" ?

mais je pense avoir fini par comprendre.

La protéine associée à l'ADN le protège des endonucléases (on est ok la dessus depuis le 1er semestre). Quand on soumet le mélange à la digestion, on recueille des fragments d'une certaine taille. C'est précisément de cette taille dont on parle avec "profil de footprinting". Qui sera possiblement modifiée en cas de mutation de la protéine en question puisque son rôle peut potentiellement être altéré.

L'année dernière, la chargée de TD nous parlait de taille d'empreinte mais je n'avais pas saisi.

A moins que "footprintig" soit tout simplement l'interaction protéine-ADN et auquel cas, on revient à ce que tu disais. Et de toute façon même finalité, protéine modifiée : pas d'interaction ou interaction modifiée et donc pas même résultat d'expérience quand on soumet à endonucléases.

Edited March 3, 2020 by LouiseHe

[Reïner]

Salut @LouiseHe

 

Je suis d'accord avec @Metallica , le terme "footprinting" a surement été choisi pour faire référence à la marque très précise que laisse une protéine se liant à l'ADN à la manière d'une empreinte de pas sur le sol. Ceci désignerait alors l’interaction protéine-adn qui comme tu l'as dit pourra être mis en évidence par l'intermédiaire de l'analyse des tailles des bandes après digestion de l'ADN par des ADNases

Edited March 4, 2020 by Reïner

[Théophylline]

Salut @LouiseHe !! 

 

Alors l'ADN footprinting est une technique pour étudier les interactions protéines-ADN. Donc, sans rentrer dans les détails, on peut comprendre pourquoi l'item est vrai : s'il y a une mutation au niveau d'un facteur de transcription, son interaction avec l'ADN peut être altérée et dans ce cas il y aura une modification du profil de footprinting (donc des résultats obtenus à partir de ce test). 

 

Sinon je pense que tu as bien compris le principe du footprinting, je vais quand même le ré-expliquer pour que ce soit plus clair mais je pense que c'est hors programme donc te prends pas trop la tête avec ça : 

Déjà regarde ce joli schéma : https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/21/Courtney_2008.jpg/688px-Courtney_2008.jpg

Pour faire le footprinting, on met dans le tube à essai : 

- soit ADN + protéine étudiée + endonucléases

- soit ADN + endonucléases (référence)

et on regarde la taille des fragments après action des endonucléases. Vu qu'on marque qu'une seule extrémité de l'ADN, tu pourras savoir en fonction de la taille du morceau d'ADN où il a été coupé par l'enzyme. 

Si la protéine interagit avec l'ADN, elle va le protéger là où elle se lie à l'ADN et empêcher l'action de l'endonucléase. Donc par exemple, si son site de liaison correspond à une séquence allant de la 45ème à la 55ème base, on n'aura pas de fragment d'ADN de 45pb, ni de 46pb, ni de 47pb ... jusqu'à 55pb. Ce "trou" observé sur l'électrophorèse correspond à ton profil de footprinting. Et pour savoir à quelle taille d'ADN ça correspond on le compare à la référence. 

 

J'espère que c'est un peu plus clair ! 

[LouiseHe]

il y a 5 minutes, Théophylline a dit :

 

 

J'espère que c'est un peu plus clair ! 

 

oui !! super clair merci.

j'avais compris dans le global mais pas dans le détail, c'est top ton explication