Immunoprécipitation et Coimmunoprécipitation

[marianne12]

Bonsoir , quelqu'un pourrait m'expliquer en quoi consiste ces deux types de purifications ? J'ai beau lire , relire et regarder des schéma je ne comprend pas ! Merci d'avance !!

[Sarahbbcch]

Bonjour Marianne12, voici une explication sur les techniques d'immunoprecipitation et de coimmunoprécipitation. J'espère que ça pourra t'éclairer sinon n'hésite pas à me le dire j'essaierai de t'expliquer autrement  

L'immunoprécipitation consiste a faire sédimenter ou précipiter une proteine d’interêt avec des AC spécifiques de la protéine d'interêt. 

☞ Exemple du cours : On cherche à purifier/immunoprécipiter le récepteur de PDGF (PDGF-R), c'est une étude de signalisation, c'est à dire qu'on cherche dans quels cas le récepteur est exprimé. 

1. On fait une incubation contrôle : on prend des fibroblastes en culture (qui expriment le PDGF ainsi que son récepteur), on les mets a 37° et on les met à incuber dans un milieu tamponné sans aucun agoniste. 

2. On récupère les cellules, on les lyse en leur appliquant une hyper-pression/depression ou des ultrasons et on obtient un homogénat cellulaire qui contiendra notamment du PDGF et son récepteur (PDGF-R) . 

3. On ajoute un AC spécifique du récepteur au PDGF qui va accrocher/ se fixer sur le récepteur.

4. Pour marquer les complexes AC/PDGF-R et pouvoir les purifier plus facilement ultérieurement, on ajoute à l'homogénat la protéine A du staphylocoque fixée sur des microbilles de sépharose. La protéine A interargit de manière non spécifique avec les fragments Fc des AC.  
5. On centrifuge et on obtient un immunoprécipité. 

6. On récupère l’immunoprecipité dans le culot et on le re-suspend dans un milieu avec du SDS qui va permettre de séparer les proteines par electrophorèse. Les éléments qu’on a sédimenté par centrifugation sont les billes de sépharose couplées a la proteine A, l’AC anti-PDGF-R et le recepteur au PDGF. 
7. On incube ces éléments sédimentés avec du PDGF donc nous stimulons les cellules avec du PDGF. Le PDGF va reconnaître le récepteur au PDGF, récepteur doté d'une activité tyrosine kinase et provoquer sa phosphorylation (la stimulation du PDGF-R par le PDGF provoque sa phosporylation). Les groupements tyrosine phosphate (résultant de la phosporylation du récepteur) vont servir d’ancrage à des proteines de la signalisation comme la PI3 kinase. La PI3 kinase possède une partie regulatrice qui est associée par des liaisons faibles à une partie catalytique qui va convertir le PIP2 en PIP3. 
8. On fait une immuno-précipitation du récepteur en présence d’un AC spécifique et des billes de protéine A-cépharose. 

9. On sédimente grâce a la centrifugeuse et dans le culot de sedimentation on retrouve les éléments suivants dissociés par le SDS : les billes de sépharose, le PDGF-R phosphorylé, l’AC anti-PDGF-R, la PI3 kinase scindée par le SDS en ses 2 sous unité catalytique et regulatrice. 
10. On fait un Western-Blot qui consiste à déposer l’immunoprecipité sur une plaque de nitrocellulose qu’on met en contact avec : 
*un AC anti-PDGF-R :  on voit deux bandes identiques quand il y a ou non du PDGF donc qu’il y a des récepteurs au PDGF que la cellule soit ou non stimulée par le PDGF. 
*Un AC dirigé contre la sous unité regulatrice de la PI3 kinase : on voit une bande quand il y a du PDGF et aucune bande quand il n'y en a pas donc la PI3 kinase est absente en absence de PDGF et présente en présence de PDGF.
*Un AC anti-tyrosine phosphate : on voit une bande quand il y a du PDGF et aucune quand il n'y en a pas donc elle est absente en absence de PDGF et présente en présence de PDGF.
➔ Au départ on cherchait à purifier/immunoprécipiter le PDGF-R et finalement on a purifié le PDGF-R + la PI3 kinase, on a donc co-immunoprecipité la PI3 kinase avec le recepteur au PDGF. 

[marianne12]

Merci !! Je pense avoir compris du coup je vais voir ça en faisant quelque qcm !! 

[Sarahbbcch]

Super, si jamais tu bloques sur les qcms hésite pas à demander d'autre explications, ici ou sur dans un nouveau sujet. Bon courage