Clonage d'un fragment d'ADN dans un plasmide

[aliceDS]

Salut ! J'ai du mal à comprendre les étages du clonage dans le plasmide, à quel moment le plasmide est modifié ? 

[AlexandreTrapé]

Salut, ta question est vague donc je te fais toute la séquence 

 

Tu veux un plasmide recombinant = plasmide sauvage (donc avec site ORI, gène résistance à ampicilline et site de clonage multiple ajouté par l'Homme) sur lequel tu fais agir une enzyme de restriction (ER) pour l'ouvrir et la PA afin d'enlever les 5'P (le plasmide ne peut donc plus se refermer). 

Entre temps, tu auras traité ton ADNc par la même ER afin d'avoir des extrémités compatibles avec le plasmide, et  l'ADNc possédera des extrémités 5'P lui, donc pourra se lier).

Le plasmide traité et l'ADNc traité seront incubés en présence de ligase et d'ATP => liaison 5'P (ADNc)/3'OH (plasmide). Les deux ponts phosphodiesters restant 5'OH(plasmide)/3'OH(ADNc) seront rétablis plus tard dans la bactérie.

Pour finir, tu amplifies les plasmides, transformes les bactéries puis les sélectionnes 

[aliceDS]

Ce que je comprend pas c'est d'où vient le plasmide qu'on modifie. Est ce qu'il est déjà présent dans E. coli ? Et les bactéries qu'on transforme ce sont d'autres bactéries qui n'ont rien avoir avec celles utilisées pour l'amplification ? 

[AlexandreTrapé]

Les plasmides sont présents dans la plupart des bactéries, y compris E. Coli en revanche après amplification des plasmides on aura une lyse bactérienne afin de récupérer les plasmides (surnageant) donc les bactéries lysèes ne pourront en aucun cas être rèutilisées.

Les bactéries compétentes utilisées pour la transformation sont d’autres bacteries qui peuvent accueillir le plasmide recombinant et n’en possède pas (car elles ont été rendue compétentes), le plus souvent les chercheurs utilisent E. Coli car elle est bien connue et facile d’utilisation

[aliceDS]

Ok merci beaucoup !